Application Note 細菌増殖アッセイの高度なカイネティック解析

はじめに

Michel Hoogenkamp｜研究技術者｜アムステルダム歯科学術センター（ACTA）
キャサリーン・サロモ｜フィールドアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

院内感染では、殺菌困難な細菌が問題となっている。これらの細菌を死滅させる化合物の同定は、多くの製薬会社が関心を寄せている。これらの化合物の有効性をスクリーニングするためのアッセイの開発と最適化は、多くの微生物学者が直面する課題である。

ここでは、SoftMax® Pro 7.0（またはそれ以上）のデータ収集・解析ソフトウェアを用いた細菌増殖アッセイのセットアップについて説明します。細胞密度とGFPシグナルの両方を、Workflow Editorの取得機能を用いて時間経過にわたって記録した。GFPシグナルを細胞密度に正規化したり、増殖速度やその他のカイネティック関連情報を抽出するなど、ソフトウェアにおける様々なデータ形質転換ステップについて説明する。

材料

• エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）OG1RF株、封じ込め：

◦プラスミドpMV158-GFP（緑色蛍光タンパク質）

• 96ウェル黒壁μClearマイクロプレート（Greiner Bio-One cat.）
• qPCRシール（Eurogentec社製 cat.）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices cat：

◦SoftMax Pro 7.0（またはそれ以上）ソフトウェア

方法

ワークフローエディターを用いたデータ取得

オランダのAcademic Centre for Dentistry（ACTA）の予防歯科科で、SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して細菌増殖データを取得しました。ここでは、プラスミドpMV158-GFPを封じ込めたEnterococcus faecalis OG1RF株を様々な増殖条件で使用した。GFP（緑色蛍光タンパク質）発現は異種発現であり、この菌株はHoogenkampらの発表に記載されており1、GFPは染色が困難な種であるE. faecalisの生存率マーカーとして研究された。PBS中のE.フェカリス150μlとバックグラウンド対照としてPBSを96ウェル黒壁μクリアプレートにプレーティングした。蒸発を防ぐため、マイクロプレートをqPCRシールで覆った。その後、マイクロプレートをSpectraMax i3xリーダーにセットし、カイネティック測定の間、37℃でインキュベートした。

SoftMax Pro Workflow Editorを使用して、吸光度測定（PlateOD600）と蛍光測定（PlateGFPBottom）を含むカイネティック測定サイクルを作成し、その間に5秒間プレートを直線的に振った（図1）。吸光度を600 nmで測定し（OD600）、細菌の増殖を測定した。生存率の指標である GFP 発現は、励起波長 485 nm（バンド幅 9 nm）、発光波長 515 nm（バンド幅 15 nm）の下方測定を行う蛍光検出を用いてモニターした。両方のデータトレース（吸光度と蛍光）は、2つの独立したプレートセクションで記録した。カイネティックサイクルは15分ごとに1回、合計18時間繰り返すように設定した。オプションのソフトウェア機能により、ユーザーはカイネティック測定を一時停止したり再開したりすることができ、実行中に試薬を追加することができる（この実験では使用しなかった）。得られたデュアルReadモードのカイネティック測定データは、SoftMax Proソフトウェアを使用して解析しました。

図1. デュアルリードモードカイネティック測定のためのSoftMax Pro 7ワークフローエディター。ドラッグ＆ドロップ機能により簡単に設定でき、カスタマイズしたワークフローを迅速に設定できる。

削減設定ダイアログを使用したデータ解析オプション

データ解析の初期段階として、ユーザーはブランクを定義するかどうかを決定する必要があります。ブランクウェルの位置はテンプレートエディターを使用して設定し、グループブランクまたはプレートブランクを選択できます。プレートブランクは、各タイムポイントでプレート内の全サンプルウェルのローデータから差し引かれるのに対し、グループブランクは関連するサンプルウェルのみから差し引かれる。この実験セットアップでは、バクテリアまたは他の生物種による汚染の可能性をコントロールするために、バッファーのバックグラウンドのトレースが捕捉された。バッファーはOD600またはGFP測定のいずれにも干渉しなかったため、減算は必要なかった。培地やバッファー成分がOD600や蛍光を妨害する場合は、吸光度チャンネルまたは蛍光チャンネルのどちらかの真のシグナル値を取得するために、ブランクの減算が推奨されます。また、これにより測定値の比較可能性が高まります。

高度なカイネティックデータ解析は、リダクション設定ダイアログを通じて提供されます。図2はバクテリア増殖実験のリダクション設定を示している。メニューは、ローデータとデータ削減ステップの2つのセクションに分かれています。

リダクション設定メニューのデータ解析オプション

図2. リダクション設定メニューのデータ解析オプション。この例では、プレートセクション'PlateOD600nm'の光学密度データの対数形質転換と、それに続く曲線の最 急峻部を検索するための5つのVmaxポイントによるVmaxレート値への還元を示している。

ローデータのステップには、すべてのカイネティックトレースの最初のデータポイントをゼロに設定するオプションが含まれています。さらに、カイネティックリダクションの前または後にブランク計算を含めることができます。リダクション前」を選択すると、平均化されたブランクウェルのカイネティックデータトレースが、すべてのローデータセットから各タイムポイントで個別に差し引かれます。縮小後」を選択すると、サンプルウェルのデータから、Vmaxレートなどの縮小されたブランクウェルのデータの平均が差し引かれます。

データ削減ステップとデータ出力タイプには、以下のオプションがあります（図2）：

• 限界： 必要に応じて、データ削減分析に含まれるカイネティックデータの範囲を制限します。リミットはシグナル軸（OD、RLU、RFU）および／または時間軸（秒）に設定できます。同じ分析範囲がすべてのウェルに適用されます（図2、緑枠）。
• Wavelength Options（波長オプション）： 選択した範囲内でシグナル軸を形質転換します。デフォルトでは、最初に測定された波長（Lm1）が選択されます。シグナル軸の形質転換の例を2つ示します：
  
  • 正規化： 2つの波長データトレースが同じプレートセクション内でキャプチャされた場合、ドロップダウンメニューには、比率（波長1/波長2 = !Lm1/!Lm2）のような事前設定された選択項目が表示されます。このアプリケーションノートに記載されているデータ例では、データトレースは2つの別々のプレートセクションで取得されているため、レシオメトリックシグナルの正規化にはカスタム式が必要でした。GFPシグナルをバクテリアの細胞密度に正規化するために、以下の式を入力した：
    KinPlot@PlateGFPBottom/KinPlot@PlateOD600。これを2つのプレートセクションのどちらかに適用した。!KinPlot式は、記号'@'と対応するプレートセクション名で参照される指定されたプレートセクションのカイネティックデータセットを抽出した。ローデータ・トレースと形質転換（正規化）データ・トレースの比較図を図3に示す。

OD600における細胞密度に正規化したGFPシグナル。

• • 対数スケーリング： の指数関数的成長段階を線形化するために、OD
  • 600
  • データトレースの指数関数的成長段階を直線化するために、OD 600で対数変換を適用した。
  • 600
    プレートセクションで対数変換を適用した。図2（青枠）に示すように、Ln(!Lm1)と入力して自然対数を使用するカスタム式を追加した。ローデータと対数スケーリングデータの比較を図4に示す。

• 図4. OD600データに対数スケーリングを適用したローデータと縮小データのビュー。各実験条件の例としてウェルA1～A5を使用。上：OD600カイネティックデータトレースのローデータ（青線）。下：対数スケーリングで形質転換したローデータ（黒線）と、Vmaxデータ削減を適用して指数関数相の成長速度を決定したもの（オレンジ線）。対応する削減設定を図2に示す。
• カイネティックリダクション： このステップでは、各データトレースをVmaxレートやOnset Timeのような削減された単一の値にさらに形質転換します。利用可能な事前設定済みカイネティックリダクションパラメータの全リストと詳細は表1に記載されています。上記の対数スケーリングの例は、カイネティックリダクションを説明するために使用されています：

表 1. 事前に設定されたカイネティック削減オプション。

• OD 600データトレースの対数変換の後続ステップとして、図2（赤枠）に示すようにVmaxレートを抽出することにより、最大成長率を取得することができます。Vmax率は、勾配を決定するために使用される線分の最大サイズを定義するVmaxポイントをユーザーが調整できるという利点を提供します。Vmaxはカイネティック縮小プロットではオレンジ色の線で表示されます（図4、縮小データビュー）。プレートセクションビューで全ウェルのカイネティック縮小グラフを最適に比較するには、「Display（表示）」から「Reduced Data（縮小データ）」を選択し、「Plot（プレーティング）」オプションを選択します。
  異なる増殖条件を数値として表形式で比較するには、テンプレートエディターツールを使用すると、ウェルをサンプルグループに割り当て、図5（上）に示すように、縮小データ（Vmax rate）を表形式で表示できます。その後の計算ステップにより、増殖率（k）と倍加時間（g）の両方が得られます。データをより見やすくするために、結果を棒グラフで表示することもできます（図5下）。

図 5. 結果表示オプション。プレート断面の縮小データ表示と、E. faecalisの各実験条件（カラム1～5、n=8）の結果が、棒グラフと同様に結果表にまとめられている。Vmax率は、増殖速度（k=Vmax*3600）と倍加時間（g=ln2/k）の両方を取得するために使用された。

結論

SoftMax Pro 7 ソフトウェアのワークフローエディターは、SpectraMax i3xリーダーを含むMolecular Devicesマルチモードマイクロプレートリーダーとともに、光学密度および蛍光タンパク質発現と同時にデュアルリードモードカイネティック測定データを記録する柔軟性を提供します。解析はSoftMax Proソフトウェアに組み込まれており、データの正規化や対数スケーリング調整など、細菌増殖データのさまざまなデータ解析オプションや形質転換を提供します。Vmax速度やオンセット時間など、さまざまなカイネティックデータ削減パラメーターがソフトウェアにあらかじめ設定されています。希望するデータ出力パラメータは、表やプレート形式で簡単に統合でき、棒グラフや散布図としてグラフ化できるので、さまざまな実験条件の評価をサポートします。

参考文献

1. Hoogenkamp MA, Crielaard W, Krom BP. Enterococcus faecalisにおける生存率マーカーとしての緑色蛍光タンパク質の用途と限界： 観察的調査。J. Microbiol. Methods (2015) Aug;115:57-63.