セルカウント 様々な方法、技術、テクノロジーを用いたセルの数え方を学習
自動細胞イメージングを用いたセルカウンティング
セルカウンティングは、多くの生物製剤実験において基本的かつ重要です。薬剤の毒性、細胞増殖、細胞分裂の阻害などのアッセイでは、ウェル内の細胞の数や密度を評価する必要があります。自動イメージングを使用すれば、手作業や人的ミスを減らしながら、細胞計数プロセスを大幅にスピードアップすることができます。
以下のワークフロー例では、ユーザーがサンプルをImageXpress® Pico自動細胞イメージングシステムにセットし、ソフトウエアで簡単なセットアップを行えば、システムが自動的に細胞をカウントし、ユーザーは離席時間を持つことができます。透過光下での標識不要細胞計数や蛍光イメージングによる核色素検出など、さまざまな方法で細胞を計数できます。
ステインフリーセル検出技術：
標識不要の細胞数・
細胞浮遊度分析法
細胞ベースアッセイの画像イメージングには通常、蛍光プローブを使用する必要がありますが、蛍光プローブは生細胞に対して毒性があったり、固定された細胞でしか機能しない場合があります。標識不要の細胞数と細胞蛍光の分析法は、細胞の増殖と健全性を定量的にモニタリングすることができます。これにより時間のかかる作業で細胞生存性を損なう可能性が生じる問題を回避できます。
SpectraMax® i3 マルチモードマイクロプレートリーダーとSpectraMax® MiniMax™ 300イメージングサイトメーターは、独自のStainFree™ Cell Detection Technology（特許出願中）を使用しているため、DNAとインターカレートするDAPIのような核染色や、長期的に細胞に毒性を示す生細胞染料を使用せずに、細胞増殖、細胞毒性、その他のアッセイを行うことができます。
StainFree テクノロジーによるセルカウント
StainFree細胞検出アルゴリズムは、特許取得済みの透過光（TL）分析技術を使用して、細胞計数およびコンフルエンス測定のための細胞染色を排除します。ここでは標識不要法を用いた、一般的に使用される様々な種類の細胞の分析について説明します。
セルカウントの方法と技術
マルチウェルマイクロプレートで正確なセル数を定量できれば、細胞の健康状態や増殖を研究する多くの生物製剤が可能になります。これらのアプリケーションは、蛍光染色した核をイメージングするエンドポイントアッセイを利用する場合もあれば、染色していない生細胞や固定細胞の透過光イメージングをロバスト性で要求する場合もあります。いずれの場合も、ソフトウエアによるセグメンテーションによる細胞の列挙は、高速で信頼性の高いものでなければなりません。
ここでは、自動イメージングシステムと解析ソフトウエアを使用し、明視野または蛍光イメージングのいずれでも迅速に行うことができる細胞計数を用いて、増殖、細胞毒性、コンフルエンシーを評価するために活用される様々な方法と技術について説明します。
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細胞生存能へのアクセス
細胞生存率は、細胞膜の完全性や細胞酵素の活性などのパラメーターを調べることで評価できます。マイクロプレートリーダーでは、蛍光試薬を用いてこれらのパラメーターを検出することができます。例えば、赤色の細胞不透過性DNA結合色素は、細胞膜が損なわれている死細胞や瀕死の細胞のみを染色し、緑色の生細胞色素は、代謝酵素が活性化している時のみ蛍光を発します。
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DAPI染色に代わる方法
DAPI（4'、6-ジアミノ-2-フェニルインドール）は、核DNAの染色によく用いられる蛍光色素です。蛍光顕微鏡、染色体拡散、FACS、細胞ベースアッセイなどの画像イメージング実験に用いられます。しかし、紫外線で励起するとDAPIが光変換し、イメージングシステムのFITC/GFPチャンネルでDAPIの蛍光が検出されるため、結果の解釈に誤差が生じます。DAPIはまた、最大限の染色のためにセルを固定する必要があります。ここでは、染色を全く必要とせず、生細胞で使用できるStainFreeテクノロジーを含む、DAPI染色に代わるいくつかの方法を紹介します。
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セル染色なしで細胞を数える >
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トランスフェクション効率
の計算
トランスフェクション効率を測定することで、研究者は改変細胞を標的アッセイに使用する前に、遺伝子編集の収量を早期に知ることができます。透過光と、細胞のトランスフェクションを示す蛍光イメージャーの両方で、高品質の画像を取得することができます。画像解析ソフトウェアは、すべての細胞を識別し、カウントし、GFP陽性か否かをスコア化します。その後、その比率からトランスフェクション効率を算出することができます。
SpectraMax i3マルチモード検出プラットフォームによるGFPトランスフェクションの最適化 >
マイクロプレートリーダーでのイメージングとウェスタンブロット検出を用いたCRISPR編集細胞の検証 > -
セルサイクル分析
蛍光標識された細胞周期タンパク質は、周期的に発現・分解されます。FUCCI技術は、細胞周期依存性タンパク質であるgemininとCdt1の過剰発現に基づいており、それぞれ緑色の蛍光色素と赤色の蛍光色素に融合しています。Cdt1レベルはG1期にピークを迎えるため、G1期の細胞は緑色に見えます。ジェミニンレベルはS期後期、G2期、M期に上昇するため、これらの期の細胞は赤色に見えます。
ライブセルアッセイを用いた細胞周期阻害剤の評価 > -
セル遊走
細胞遊走とは、広義には細胞がある場所から別の場所へ移動することと解釈され、胚発生、創傷治癒、免疫学的反応など、多くの生物学的事象に必要不可欠なプロセスです。腫瘍細胞の周辺組織への浸潤や転移は、in vitro細胞遊走法を用いて研究できるがんの領域です。
生細胞の不連続タイムラプスイメージングを用いた細胞遊走の測定 >
シンプルなスクラッチアッセイとタイムラプス生細胞イメージングを用いた細胞遊走測定 >
オリスプロアッセイによるセル遊走解析 >
FluoroBlokインサートを用いた細胞遊走の評価 > -
蛍光マーカーでセルを数える
異なる蛍光マーカーで陽性に染色されたセルに基づいて、化合物の効果を画像化し、解析します。一貫性のある統計学的な定量分析により、濃度の異なる複数の化合物の試験が可能になります。蛍光イメージャーまたは透過光イメージングを用いた細胞計数の違いについては、アプリケーションノートをお読みください。
自動イメージングを用いて蛍光ラベルの有無にかかわらず細胞をカウントする > -
透過光によるセルカウント
透過光セグメンテーション（解析）アルゴリズムは、多様な細胞タイプの計数精度を向上させ、通常、染色されていない生細胞や固定細胞のイメージングに使用されます。蛍光核や細胞体を検出する標準的な細胞計数法に加えて、透過光セグメンテーション（解析）アルゴリズムは、多様な細胞タイプの計数精度を向上させます。透過光細胞計数を実行するためのパラメータ設定方法については、ビデオをご覧ください。
透過光画像解析による細胞カウントと細胞毒性効果の評価 >
SpectraMax MiniMax サイトメーターの透過光を用いた細胞計数法の改善 >
ImageXpress Picoでの透過光セルのスコアリング >
MetaXpressの透過光解析モジュールによるセルのカウント > -
細胞の細胞毒性を検出する
細胞毒性は多くの場合、実験的治療や潜在的薬剤に反応して測定されます。治療された細胞の細胞毒性を簡単にスクリーニングする方法を持つことは、新しい治療法を同定したり、細胞の健康に影響を与える細胞シグナリング経路を理解したりする上で極めて重要です。細胞毒性を示す一般的な指標としては、細胞集団のATPレベルや細胞膜の完全性があり、いずれもマイクロプレートベースの様々なアッセイを用いて測定することができます。
SpectraMax iD3リーダーによる細胞生存能アッセイで細胞の健康状態を測定する >
iPSC由来肝細胞を用いたマルチプレックスハイコンテント肝毒性アッセイ >
透過光画像解析による細胞カウントと細胞毒性効果の評価 > -
イメージサイトメトリー
イメージサイトメトリーは、低倍率顕微鏡とイメージングおよび解析ツールを組み合わせた細胞計数技術です。イメージサイトメトリーは、1回のアッセイで多数の細胞集団の幅広い細胞特性に関する情報を提供するのに有用です。イメージサイトメトリーは、非標識または蛍光標識細胞に使用することができ、細胞集団に対して複数回実施することで、経時的な細胞動態に関する情報を得ることができます。