Application Note SpectraMaxパラダイムマルチモードマイクロプレート検出
プラットフォームでのAlphaLISAスクリーン

はじめに

感染、刺激、その他の傷害に対する身体の反応である炎症は、内皮ケモカイン産生および接着分子発現の増加を伴い、その結果、好中球が広範囲に浸潤する可能性がある。これらのパラメーターを低下させ、組織損傷を抑制することができる新規抗炎症物質の探索は、大きな治療的可能性を秘めている。これらの新規治療薬のスクリーニングには、サイトカイン定量用の高速かつ高感度なプラットフォームが必要です。

Molecular Devices SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレート検出プラットフォームは、ユーザーによるアップグレードが可能なマルチモードマイクロプレートリーダーであり、2分以内にリアルタイムでシステムを構成することができます。アルファテクノロジーの機能は、ユーザーの検出ニーズの変化に応じて、いつでもシステムに追加することができます。

SpectraMax Paradigmプラットフォームは、サイトカインTNFαを迅速に定量し、TNFα刺激ヒト内皮細胞におけるシアノバクテリア由来抗炎症代謝物の高感度スクリーニングを実施するために使用された。マイクロプレートフォーマットで分子間相互作用を研究するためのビーズベースの均一性アッセイであるAlphaLISA®は、サイトカインの定量と、新しい治療薬の開発につながる可能性のある抗炎症性シアノバクテリア画分のスクリーニングの両方に使用された。細胞単層にダメージを与える洗浄工程がある従来のELISA法と比較して、AlphaLISA法は細胞の損失を最小限に抑え、その結果、標準偏差が小さく、より正確な結果が得られた。

TNFαの精製と定量

最初のステップは、内皮細胞の炎症反応を刺激するアッセイに使用できる精製TNFαタンパク質を得ることであった。この目的のために、ヒトサイトカインTNFαを酵母Pichia pastorisで発現させた。この酵母は、細胞ベースアッセイを妨害するエンドトキシンを含まず、大量の組換えタンパク質を産生する。酵母培養1リットル当たり10-20mgの生物学的に活性なタンパク質が精製された。SpectraMax Paradigmプラットフォームは、AlphaLISA法を用いてタンパク質を低ピコモルレベルまで定量することができました（図1）。最適化されたリーダー設定を備えた事前設定プロトコールにより、384ウェルプレートをわずか2分で読み取ることができた。

図1. TNF標準曲線。SpectraMax Paradigmプラットフォームで低ピコモルレベルまでTNFαを定量。アッセイウインドウは4桁に及ぶ。

炎症性因子の検出

次に、TNF-α刺激に応答して内皮細胞が産生する炎症性因子のレベルを検出するAlphaLISAアッセイが開発された。ヒト肺微小血管内皮細胞（HLMVEC）を上記で精製したヒト組み換えTNF-αで処理し、細胞間接着分子1（ICAM-1）の発現を誘導した。ICAM-1は、TNF-αとの18時間のインキュベーションにより発現が上昇した。ICAM-1の発現レベルはAlphaLISAを用いて定量した（図2A）。

図2. HL-MVECにおけるICAM-1とIL-8のアップレギュレーション。18時間のTNF-α刺激後、HL-MVECにおけるICAM-1（A）とIL-8（B）のアップレギュレーションをSpectraMax Paradigm Platform上のAlphaLISAを用いて測定した。

TNFαまたはLPSで刺激された内皮細胞は、in vivoで炎症組織に浸潤する好中球の強力な化学誘引物質であるIL-8を分泌する。したがって、内皮細胞から分泌されるIL-8の定量は、in vitroにおける血管内皮細胞の炎症促進状態に関する貴重な情報を提供することができる。分泌されたIL-8のレベルを評価するために、αLISAを用いて刺激したHL-MVEC細胞の細胞培養上清を分析した（図2B）。

抗炎症化合物を同定するための内皮細胞ベースのスクリーニング

シアノバクテリアは藍藻としても知られ、代謝産物の驚くべき多様性を有している。その一部は、現在炎症性疾患の治療薬として試験されている治療上有望な化合物である1,2,3。HL-MVECをシアノバクテリアNostocから単離した異なる画分で前処理した後、0.4 ngのヒトTNF-αで刺激した。18時間後、ICAM-1のアップレギュレーションをSpectraMax Paradigm PlatformのAlphaLISA技術を用いて測定し、さらに細胞培養上清をIL-8分泌について分析した。藍藻画分8721,6（図3）は、ICAM-1産生の有意な減少を示し、抗炎症活性を示した。この画分もIL-8分泌の明らかな減少を示した（データは示さず）。AlphaLISAの前に細胞毒性試験を行い、この画分は細胞の健康にほとんど影響を与えないことが示された。

図3. 抗炎症性シアノバクテリア画分のスクリーニング。αLISAを用いて、TNFα刺激HL-MVECにおけるICAM-1アップレギュレーションに対するシアノバクテリア画分の効果を分析した。フラクション8721,6はICAM-1産生を有意に減少させた。

結論

SpectraMax Paradigm PlatformとAlphaLISAの併用により、病態に関連した内皮細胞ベースのモデルで新規治療薬をスクリーニングするための強力なツールが提供される。SpectraMax Paradigm Platformは、最大1536ウェルの検出が可能な感度とスピード、および最適化済みのソフトウェア・プロトコルと組み合わせることで、より迅速な立ち上げを可能にし、Alphaテクノロジーを用いたスクリーニングに最適な選択肢となっている。

謝辞

ここで紹介するデータを惜しみなく提供してくれたオーストリア、クレムスのIMC応用科学大学のMaren Plüger、Anita Eigner、Maria Hirschler、Linda Kotnik、Katrin Fuchslueger、Julia Schweiger、Christoph Wiesner、Andreas Eger、Wolfgang Schütt、Harald Hundsberger、およびチェコ科学アカデミーのJiri Kopeckyに感謝する。

参考文献

1. Rasool, M.; Sabina, E. P.; Lavanya, B. Biol Pharm Bull 2006,29(12), 2483.
2. Romay, C.; Armesto, J.; Remirez, D.; Gonzalez, R.; Ledon, N.; Garcia, I. Inflamm Res 1998, 47(1), 36.[31].
3. Prinsep, M. R.; Thomson, R. A.; West, M. L.; Wylie, B. L. J Nat Prod 1996, 59(8), 786.

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