Application Note ImageXpress Microシステムと
EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488アッセイキット
によるアポトーシス検出

はじめに

アポトーシスは、胚発生などの正常な生理過程において、細胞のプログラムされた死を信号伝達する重要なメカニズムであり、がんや神経変性疾患などの疾患においても重要な役割を果たしています。

EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488アッセイキットは、NucView 488 Caspase-3基材を使用することにより、完全な細胞集団内のアポトーシスを検出することができます。この基質は、Caspase-3/7 DEVD認識配列に結合した蛍光性DNA色素から構成されています。最初は無蛍光で、細胞膜を透過します。細胞がアポトーシスしている場合、細胞基材はCaspase-3/7によって切断され、核に入りDNAに結合する色素を放出し、明るい緑色の蛍光を発します。死細胞やアポトーシス細胞を除去する可能性のある洗浄ステップなしで、細胞を生きたままイメージングすることができますが、色素は固定後も保持されます。

このフレキシブルなアッセイは、ImageXpress® MicroハイコンテントイメージングシステムとMetaXpress®解析ソフトウェアを用いてウェル中のアポトーシス細胞の発生率を計算することができます。

材料

• EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 アッセイキット (Explorer Kit Cat. No. R8350またはBulk Kit Cat. No. R8351)
• CHO M1WT3細胞
• カンプトテシン
• 384ウェル黒色透明底マイクロプレート（Corning Falcon）
• DRAQ5核染色
• ImageXpress Micro ハイコンテントイメージングシステム

アッセイ方法

CHO細胞を384ウェル組織培養処理マイクロプレートに1ウェルあたり50μLで3,500個プレーティングしました。37℃、5% CO₂のインキュベーター内で一晩接着させ、増殖させました。その後、アポトーシスを誘導するために、100 µMから0.1 µMまでのカンプトテシン（抗がん剤）の1:2希釈系列でウェルを24時間処理しました。

NucView 488基質の10 µM 2Xワーキング溶液を温めた培地で調製しました。各ウェルから25µLを注意深く吸引し、25µLの2X基質溶液と交換して最終濃度を5µMにしました。細胞を37℃で1時間インキュベートした後、DRAQ5核染色液の6倍液を各ウェルに10µLずつ加え、最終濃度を2µMとしました。30分間のインキュベーション後、FITCおよびCy5フィルターセットと10X Plan Apo対物レンズを用い、ImageXpress Microシステムでプレートを読み取りました（図1）。この倍率では、1視野で通常1,100～1,400個の核をとらえるので、1枚の画像で統計学的に適切な結果が得られます。

データ解析

ImageXpress®Microイメージングシステムで撮像された細胞は、Cell Scoringモジュールを用いてMetaXpress®ソフトウェアで解析されました。直感的なユーザー入力により、このモジュールはDRAQ5で染色された核を総細胞数として同定し、Caspase 3/7 positiveの核をアポトーシスとして分類します。核のサイズ、強度、アポトーシスの割合など複数のパラメータを評価することができます。化合物曝露に反応する肉眼的毒性がアポトーシスの評価を妨げる場合、細胞数が特異性を下回るウェルは解析から除外することができます。

結果

アポトーシス細胞のパーセント対カンプトテシン濃度をグラフ化し、4-parameter curve fitを適用した結果、EC₅₀値が5.7 µMの濃度反応曲線が得られました（図2）。ImageXpress MicroシステムおよびMetaXpress®ソフトウェアとともに使用されるEarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 アッセイキットは、科学者にアポトーシスの迅速かつロバストな画像ベース定量をご提供します。

このモレキュラーデバイスシステムと互換性があります

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