Application Note SpectraMax iDシリーズで実現する
カルシウム動員アッセイ最適化

Mark McPate PhD｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Simon Lydford｜アプリケーション・サイエンティスト・マネージャー｜モレキュラーデバイス

はじめに

ラボの要件は進行中の研究ニーズに応じて変化することが多いため、吸光度、発光、蛍光など複数の検出モードを提供するマルチモードプレートリーダーを備えることは必須となっています。さらに、容易にアップグレード可能なプレートリーダーを持つことも重要です。たとえば、セルベースアッセイを実施するための分注オプションを提供することで、柔軟性、コスト削減、そして複数の専用装置を購入する場合と比べてベンチスペースの削減が可能になります。

生化学アッセイからセルベースアッセイへの移行を検討している研究者は、通常、各プレートからできるだけ多くの情報を抽出したいと考えています。代表的な例としては、GPCRを介したカルシウムシグナルの動態検出やイオンチャネル活性の測定があります。これらのアッセイでは、シグナルは数秒以内に最大値に達し、その後減衰するため、化合物の注入と同時にリアルタイムでモニタリングする必要があります。

ここでは、デュアルインジェクターシステムを搭載したSpectraMax® iD3およびiD5マルチモードプレートリーダーを使用して、細胞内カルシウム変化をモニタリングする情報量の多い蛍光ベースのアッセイを開発する方法をご紹介します。さらに、洗浄不要のFLIPR® Calcium 6および6-QF Assay Kitを使用することで、アッセイのシグナルウィンドウを拡大し、アッセイの信頼性を向上させ、接着細胞と浮遊細胞の両方に対応する柔軟性を提供します。

SpectraMax iD3およびiD5プレートリーダー上で2種類のアッセイを開発し、業界標準であるFlexStation® 3マルチモードプレートリーダーで実施した同じアッセイと比較しました。最初に、FLIPR Calcium 6 Kitを用いて、1321N1ヒト星状膠腫細胞株におけるムスカリン性アセチルコリン受容体を研究するための接着細胞アッセイを確立しました。次に、ヒト単球系浮遊細胞株であるTHP-1細胞に着目し、FLIPR Calcium 6-QF Assayを用いてプリン作動性P2Y受容体を研究するためのシンプルなワークフローを開発しました。

材料

試薬

• 1321N1細胞 (ECACC)
  ⚪︎培地 DMEM＋2mMグルタミン＋10％ウシ胎児血清（FBS）
• THP 1細胞（ECACC）
  ⚪︎培養培地： RPMI 1640 + 2mM グルタミン + 10%ウシ胎児血清 (FBS)
• カルシウムとマグネシウムを含むハンクス平衡塩類溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich）
• 塩化カルバモイルコリン（Sigma-Aldrich）
• 塩化アセチルコリン（Sigma-Aldrich）
• アトロピン（Sigma-Aldrich）
• ピレンゼピン二塩酸塩（Sigma-Aldrich）
• アデノシン5′-三リン酸（ATP）二ナトリウム塩（Sigma-Aldrich）
• ウリジン5′-三リン酸（UTP）二ナトリウム塩（Sigma）
• プロベネシド（AAT Bioquest）
• FLIPR Calcium 6 Assay Kit（モレキュラーデバイス）
• FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit（モレキュラーデバイス）

装置

• SpectraMax iD3およびiD5マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
  ⚪︎SpectraMax インジェクターカートリッジ（モレキュラーデバイス）
• FlexStation 3マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
  ⚪︎8チャンネルピペッターヘッドキット（モレキュラーデバイス）

マイクロプレート

• CellBIND 96 ウェル黒色壁、透明底プレート、滅菌済み (Corning)
• Greiner 96-ウェルプレート、丸底透明ウェル、無菌 (Greiner)

方法

細胞調製

1321N1「アッセイ対応」凍結細胞を迅速に解凍し、補充したDMEM培地200 μL中に1ウェルあたり2 × 10⁴細胞を播種し、96ウェル黒壁・透明底プレートに配置しました。細胞は37°C、95％湿度、5％CO₂で一晩インキュベートしました。

THP-1細胞は補充したRPMI培地中で浮遊培養し、37°C、95％湿度、5％CO₂で維持しました。使用当日、各アッセイに必要な細胞数を50 mL遠心管に分注し、1,000 rpmで5分間遠心しました。

色素負荷

1321N1細胞の場合、培養培地を除去し、各ウェルにFLIPR Calcium 6試薬（プロベネシド含有）200 μLを添加しました。プレートは37°C、5％CO₂で1時間45分間インキュベートし、その後室温で15分間インキュベートしました。

THP-1細胞の場合、遠心後、細胞をFLIPR Calcium 6-QF試薬（プロベネシド含有）に再懸濁し、濃度は1.25 × 10⁶ cells/mLとしました。Calcium 6-QFはマスキング色素技術を使用せず、ウェル底に単層で存在しない真の浮遊状態の細胞をアッセイするのに最適です（図1）。細胞は37°Cの振とう式水浴で2時間インキュベートし、アッセイの2分前に細胞懸濁液180 μLを各マイクロプレートウェルに分注しました。

アッセイプロトコール

アゴニストの濃度反応曲線は、SpectraMax iD3またはiD5プレートリーダーにSpectraMax Injector SystemとSmartInject™テクノロジーを搭載し、1回に1濃度ずつ取得しました。キャリーオーバーを最小化するため、各濃度反応曲線は低濃度から高濃度へ順に実施しました。インジェクターは化合物でプライミングし、色素負荷済みの細胞プレートを装置にセットして、各濃度について3ウェルずつでアッセイを実施しました。1321N1細胞の場合、SmartInject™テクノロジーを使用して、各ウェルに5倍濃縮化合物50 μLを注入し、注入中にマイクロプレートを振とうして試薬の混合を確実にしました。設定は図2を参照してください。

THP-1細胞の場合、FLIPR Calcium 6-QF試薬に懸濁した細胞180 μLをマイクロプレートの3ウェルに分注し、1321N1細胞での化合物添加と同様のプロトコールを使用しましたが、注入アーティファクトを最小化するために、10倍濃度のアゴニストを20 μLと少量添加しました。その後、インジェクターを逆流させてラインから化合物を除去し、次の高濃度化合物でプライミングしました。新しいプレートセクションを作成し、次の3ウェルセットでアッセイを実施しました（図3）。

このプロセスは各化合物濃度について繰り返しました。SoftMax Pro 7.1ソフトウェアのAcquisition Plan Editorを使用して、装置およびインジェクター設定を定義しました（図2）。

アンタゴニスト試験（1321N1細胞のみ）では、細胞培養培地を除去し、各ウェルにFLIPR Calcium 6アッセイ試薬180 μLを添加しました。細胞は37°Cで105分間インキュベートし、その後10倍濃度のアンタゴニスト20 μLを添加し、さらに室温で15分間平衡化しました。次に、アゴニスト（5倍濃度）を50 μLずつ、インジェクター1または2を使用して三重測定で添加しました。濃度は事前に決定したEC₈₀濃度でした。

FlexStation 3プレートリーダーでも同様の色素負荷およびアンタゴニストインキュベーションプロトコールを使用しましたが、統合された8チャンネルピペッターを用いて、化合物プレートからアゴニストの7濃度とバッファーコントロールを同時に細胞プレートの各列に分注しました。また、アンタゴニスト試験ではアゴニストEC₈₀濃度の8反復を分注しました。

結果

SpectraMax iD3およびiD5プレートリーダー（デュアルインジェクターアップグレード搭載）を使用することで、接着細胞および浮遊細胞の両方で、堅牢なアゴニストおよびアンタゴニスト濃度反応曲線を取得できました。接着1321N1細胞から得られた動態データは、中スループットのFlexStation 3プレートリーダーおよびハイスループットのFLIPR® Pentaシステムで得られたデータと一致し、3つのシステムすべてで同様の最大応答を示しました（図4）。THP-1細胞を浮遊状態で使用した場合も同様の結果が得られました（図6）。

接着1321N1細胞では、細胞外バックグラウンドを低減する新しいマスキング技術を搭載したFLIPR Calcium 6試薬を使用しました。ムスカリン受容体リガンドであるアセチルコリン、カルバコール、アトロピン、ピレンゼピンに対する応答を測定しました。SoftMax Proソフトウェアに搭載された4パラメータロジスティック曲線フィットとカスタムデータ処理を使用して、アゴニストのEC₅₀値およびアンタゴニストのIC₅₀値を算出しました（図5）。

SpectraMax iD3およびiD5プレートリーダーで得られたEC₅₀およびIC₅₀値は、FlexStation 3プレートリーダーおよびFLIPR Pentaシステムで得られた同等データとともに表1に示します。3つの装置間で有意な差は認められませんでした。

表1. Calcium 6色素を負荷した1321N1細胞から得られたアゴニストおよびアンタゴニストデータ すべてのデータはμM単位で、n ≥ 3の独立実験に基づきます。*印のデータはn = 2です。FLIPR Pentaシステムのデータは過去の研究で生成されました。

浮遊細胞については、従来、色素負荷細胞をマイクロプレート底に単層で形成し、細胞層に影響を与えないようにリガンドを穏やかに添加してカルシウム反応を開始する方法を使用していました。アッセイ準備時間と細胞培養消耗品を節約しつつ、堅牢なシグナルを生成するため、Calcium 6-QFオプションを使用したワークフローを開発しました。これにより、クエンチャーの干渉なしに細胞を浮遊状態で維持でき、アッセイボリュームを調整して撹乱を最小化しながら良好なシグナルウィンドウを確保しました（図6参照）。4パラメータ曲線フィットを使用してアゴニストのEC₅₀値を算出しました（図7）。

UTPおよびATPの算出されたEC₅₀値は、FlexStation 3プレートリーダーおよびFLIPR Pentaシステムで得られた同等データとともに表2に示します。3つの装置間で大きな差は認められませんでした。

表2. Calcium 6-QF色素を負荷したTHP-1細胞から得られたアゴニストEC₅₀値 すべてのデータはμM単位で、n ≥ 3の独立実験に基づきます。

結論

SpectraMax iD3およびiD5プレートリーダーにSmartInjectテクノロジー搭載のSpectraMax Injector CartridgeとFLIPR Calcium 6および6-QFアッセイキットを組み合わせることで、接着細胞および浮遊細胞の両方で堅牢かつ再現性の高い動態アッセイを開発できることを示しました。

接着1321N1細胞では、マスキング技術を搭載したFLIPR Calcium 6試薬を使用することで、アゴニストおよびアンタゴニストデータはFlexStation 3プレートリーダーやFLIPR Pentaシステムなどの中～高スループットシステムで得られたデータとよく一致しました。さらに、THP-1細胞については、FLIPR Calcium 6 Assayのクエンチャー非使用（QF）フォーミュレーションを用いて、浮遊状態の細胞で細胞内Ca²⁺アッセイを開発できる新しいワークフローをSpectraMax iD3およびiD5プレートリーダー上で初めて実証しました。

さらに、SpectraMax iD3およびiD5プレートリーダーで得られたデータは、FlexStation 3プレートリーダーおよびFLIPR Pentaシステムで得られたデータとよく相関しました。これらのプレートリーダーは、ELISAやセルバイアビリティアッセイをすぐに実施できる、手頃でアップグレード可能なシステムです。インジェクターを追加するだけで、情報量の多いセルベースの動態アッセイを開発でき、ハイスループットシステムで開発されたアッセイと同等の結果を得ることができます。

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