Application Note 微生物のプレーティングおよびストリーキングの自動化：
QPix FLEX System による研究の高度化

Sushmita Sudarshan、Prathyushakrishna Macha（Molecular Devices, LLC）

はじめに

微生物学研究室では、微生物培養の解析を確実に行うために、精度・再現性・効率性が極めて重要となります。従来の手作業によるプレーティングやストリーキングは有効な手法ではあるものの、ばらつきが生じやすく、作業負荷が高く、汚染リスクも伴います。研究ニーズの増大やハイスループットなワークフローの重要性が高まるにつれ、プレーティングおよびストリーキングの自動化システムに対する需要は大きく増加しております。

自動化技術は微生物の分布を標準化し、接種プロセス全体の無菌性を維持しながらヒューマンエラーを最小限に抑えます。これらのシステムはコロニー分離の最適化、プレーティングの一貫性向上、ワークフロー効率化を実現し、微生物学研究者が実験規模を拡大し、微生物スクリーニングを合理化することを可能にします。さらに、自動化は作業者の疲労軽減、データインテグリティの向上、大規模アプリケーションへの対応を支援するため、現代の微生物学研究および臨床診断における重要な進展となっております。

QPix® FLEX™ Microbial Colony Picker は、コロニーのプレーティングおよびストリーキング、さらにサンプルのトレーサビリティを自動化することで、データインテグリティと再現性を向上させ、労力を要する工程を排除いたします。また、ベンチトップや低酸素チャンバー内にも容易に設置できるコンパクトな設計を維持しています。微生物研究に不可欠なワークフローを効率化し、サンプル選択を最適化することで、QPix FLEX システムは研究効率を高め、手作業の負担を軽減し、研究者がルーチン作業ではなく新たな知見の創出に集中できる環境を提供いたします。

本研究では、QPix FLEX システムによるプレーティングおよびストリーキングの自動化機能について、その精度・信頼性・効率性を検証しております。本システムは、手作業による微生物操作に伴うばらつきを排除し、コロニー分布の一貫性を確保するとともに、単一コロニーの分離性能を向上させ、プレーティングおよびストリーキング工程全体を通じて無菌性を維持いたします。

材料

方法

プレーティング

• QPix FLEX system を用いて細菌の増殖を評価し、自動プレーティングを最適化するため、Escherichia coli および Klebsiella aerogenes を対象とした一連のプレーティング実験を実施いたしました。
• E. coli は LB および LB + Ampicillin アガー培地にプレーティングし、Klebsiella aerogenes（紫色コロニー）と E. coli（青色コロニー）の識別には ECC CHROMagar 培地を使用いたしました。
• 両菌株の段階希釈液を作製し、各ランのソースファイルとして system にアップロードいたしました。
• 8‑ウェルおよび 4‑ウェルの仕切り付きプレートには標準的なプレーティングパターンを適用し、OmniTray プレートには QPix FLEX software が提供する高度なプレーティングパターンを使用いたしました。
• さまざまな希釈倍率および細菌量を、異なる領域またはプレートフォーマットに分けてプレーティングし、37°C で一晩インキュベート後、system のピッキング工程に組み込まれたイメージングツールを用いてコロニー形成を観察いたしました。

ストリーキング

• 細菌サンプルは、QPix FLEX に搭載されたカスタムチップを用いてアガー培地上にストリーキングし、単一コロニーの分離、増殖の促進、ならびにコロニー形態および純度の観察を可能にいたしました。
• ストリーキング機能ではソースカルチャーの分注は使用せず、濃度の高い細菌懸濁液または一晩培養したカルチャーにチップ先端を浸し、そのままストリーキングを行いました。
• 37°C で一晩培養した細菌カルチャーを用い、LB アガー培地および ECC CHROMagar 培地にディップストリーキングを行いました。
• ストリーキングには、結果セクションに記載した複数のパターンを使用いたしました。さらに、Custom Streaking Pattern Editor を用いて新規パターンを作成し、標準的な 9 cm LB アガー培地ペトリ皿に適用いたしました。
• プレートは 37°C で一晩インキュベートし、翌日にコロニーピッキング工程に組み込まれた装置内蔵のイメージングシステムを用いて、アガー培地上に形成されたストリーキングパターンおよび細菌コロニーを撮像いたしました。

最適化

• アガー表面上でのプレーティングおよびストリーキングにおける垂直方向の高さを最適化した結果、初期のばらつきが解消され、各ランが一貫して良好に実行されるようになり、全体的な信頼性が向上いたしました。
• プレーティングに清浄なソースカルチャーサンプルを使用することで、複数の細菌株を扱う際に生じていたクロスコンタミネーションの問題が効果的に解消され、より正確かつ再現性の高い結果が得られるようになりました。

補足事項

• デスティネーショントレイ内のアガー高さおよびソースカルチャーの濃度は、ストリーキングパターンの外観と形成されるコロニー数の双方に大きく影響いたしました。3 台の装置間でプレーティング時のアガー高さを最適化した結果、−1.3 ～ −0.5 mm の範囲が得られました。
• プレーティング時間は、プロトコルに設定されたソースプレートマップおよび廃棄処理条件に左右されました。また、高度なプレーティングモードでは、パターンの複雑性が増すため、ラン時間が延長する傾向がございました。

ソフトウェア設定

• レイアウト位置を選択いたしました。各位置は、ランで使用する構成に応じて、Source plate、Destination plate、TipBox のいずれか、またはランで使用しない場合は None として指定いたしました。
• 下図（画像 2）には、デッキ位置およびソースプレートマップを示すソフトウェアインターフェースが表示されております。ソフトウェア上でソースプレートマップを定義する際には、名称、タイプ（Sample または Control）、色、Liquid Class、ならびに容量を指定して Control 液および Sample 液を追加いたしました。定義した液体は、プレートマップ上で目的の領域を選択し、右クリックして該当する Sample または Control を選択することで、各ソースウェルに割り当てました。Location 3 には、E. coli および Klebsiella aerogenes の各種希釈系列を含む 96 ウェルソースプレートが配置されており、これらの細菌希釈液をデスティネーション側のアガープレートへのプレーティングに使用いたしました。
• プレーティングまたはストリーキング時のアガー表面上の高さは装置間でわずかに異なるため、実験を実施する前に最適化が必要でございました。
• デスティネーションプレートマップは、各ソースサンプルをデスティネーションプレート上のどの位置に配置するかを定義するものであり、ソースプレートのサンプル配置（画像 3）に基づいて設定いたしました。
• ソースおよびデスティネーションの両方のプレートマップはエクスポートして保存し、必要に応じてインポートすることで再利用いたしました。

プレーティングおよびストリーキングは3反復で実施し、得られたデータは3台の異なるQPix FLEX 装置間で解析いたしました。

結果

QPix FLEX system による自動微生物ハンドリングの性能および一貫性を評価するため、3 台の独立した装置を用いて、プレーティングおよびストリーキング実験を 3 反復で実施いたしました。本検討には、通常モードおよび高度モードのプレーティング、ならびに標準およびカスタムストリーキングプロトコルが含まれ、β‑galactosidase を発現する E. coli JM109 と Klebsiella aerogenes を対象といたしました。得られた結果は、コロニー分布の再現性と精度、無菌性の維持、選択培地およびクロモジェニック培地における表現型識別の確実性を示すものでございます。以下のセクションでは、QPix FLEX platform の精度、信頼性、および多様な運用性を示す代表的な画像と観察結果を提示いたします。

通常プレーティング

画像 4 は、β‑galactosidase を発現する E. coli JM109 の希釈系列を、LB アガー（25 µg/mL Ampicillin 添加）上にソフトウェアのプレーティングパターンを用いて塗布した結果を示しております。最も高濃度の領域（画像 4 の右下領域）では、旺盛な増殖を示す密なバクテリアローンが観察されました。希釈倍率が高くなるにつれて、明瞭な青色コロニーが出現し、各希釈系列の適切なプレーティングと lacZ 遺伝子発現が確認されました。メディアコントロール領域にはコロニー形成が認められず、プレーティング工程の正確性および環境の無菌性が担保されていることが示されました。本画像は、視認性を最適化するため Transmission 設定を 100 に構成した QPix FLEX system により取得いたしました。

画像 5．ECC CHROMagar を用いた 4 ウェルプレートであり、ソフトウェアのプレーティングパターンを使用して Klebsiella aerogenes（紫）と E. coli（青）の 2 種の異なる濃度をプレーティングしました。明瞭な色の識別と正確なコロニー分布が確認され、自動プレーティングプロセスの有効性が示されました。

高度プレーティング

画像 6．ECC CHROMagar を含む 1 ウェル OmniTray 上に、ソフトウェアの高度プレーティングパターンを用いて Klebsiella aerogenes（紫色コロニー）をプレーティングした結果です。プレーティングパターンが明瞭に確認でき、プレート全体で一貫したコロニー分布が得られました。

ストリーキング

通常ストリーキング

画像7は、Klebsiella aerogenesを用いて標準的なストリーキングパターンに従いディップストリーキングを行った1 ウェル OmniTrayを示しています。ストリーキングは、接種チップをあらかじめ決められた培養液量を使用することなく、アガー表面に直接接触させて実施しました。この方法により、濃度が不明なソースカルチャーからでも事前の希釈操作を行わずに単離コロニーを得ることができ、単離されたコロニー形成を確実に行うことができます。

画像 8 は、25 µg/mL の Ampicillin を含む LB アガーを充填した 4 ウェル分割 OmniTray に、β-ガラクトシダーゼを発現する青色の E. coli の一晩培養をディップストリーキングした結果です。

画像 9 は、Streaking Pattern Editor を用いてユーザーが設計したカスタムストリーキングパターンに従い、E. coli の一晩培養をディップストリーキングした LB アガー入り標準ペトリ皿を示しています。この方法では、ソースカルチャーを目的のトレイのアガー表面へカスタムパターンに沿って直接転写するため、希釈操作を行うことなくコロニーの分布および単離を容易にします。

結論

3 台の装置で 3 反復ずつ実施した試験により、微生物のプレーティングおよびストリーキング自動化における高い一貫性、再現性、信頼性が示されました。結果は、パターン（結果セクション参照）、精度および速度（表 1・表 2）において反復間のばらつきが極めて小さいことを示し、装置の精度を確認するとともに、複数のセットアップにわたる自動化プロセスの妥当性を裏付けるものとなりました。

観察された均一なコロニー分布、無菌性の維持、および高い精度は、本システムが多様な微生物ワークフローに対して堅牢であることを示しています。複数の装置間で結果が一貫して得られたことは信頼性をさらに高め、この自動化アプローチが微生物学的アプリケーションに非常に適していることを裏付けています。

まとめ

自動化されたプレーティングおよびストリーキング技術の導入は、微生物株の単離およびコロニー管理において、信頼性が高く効率的なアプローチであることが示されました。プレーティング試験の結果では、一貫性のある明瞭なコロニー分布が確認され、自動化システムの精度と再現性の高さが裏付けられました。特に、濃度によってコロニーの凝集度に変動が見られたことから、単一コロニーの分離および後続解析を向上させるためには、希釈条件の最適化が重要であることが示唆されます。

本システムは、さまざまなプレーティング構成やカスタムストリーキングパターンに対応できる柔軟性を備えており、専門的な微生物ワークフローへの適応性をさらに高めています。今回の設定でも単離コロニーの形成に成功しましたが、ソース培養液の希釈条件をわずかに調整することで、コロニーの分離性および識別性をさらに改善できる可能性があります。

技術的性能に加えて、プレーティングおよびストリーキング機能を自動コロニーピッカーに統合することは、微生物株ライブラリーの構築、薬剤感受性試験、合成生物学ワークフローなど、均一で再現性の高い結果が求められる微生物学的アプリケーションにおいて大きな利点をもたらします。

総じて、本研究の結果は、自動化されたプレーティングおよびストリーキングシステムが微生物ワークフローを効率化するだけでなく、精度、信頼性、サンプルのトレーサビリティを向上させることを示しており、研究用途および産業微生物学の双方において不可欠なツールであることを確認しています。