Application Note 3Dトリプルネガティブ乳がん腫瘍オルガノイドの
ハイコンテントイメージングと自動化

はじめに

Oksana Sirenko, Angeline Lim | モレキュラーデバイス
Evan F Cromwell, Ekaterina Nikolov | Protein Fluidics, Inc.
Margarite D Matossian, Courtney K Brock, Bridgette M. Collins-Burow, and Matthew E Burow | Tulane University

トリプルネガティブ乳がんは、転移、再発、薬剤耐性の発生率が高い、臨床的に攻撃的な腫瘍サブタイプです。現在、この疾患に対して臨床的に承認された低分子標的治療薬は存在せず、新しい治療標的を発見することが極めて重要です。患者由来の細胞ベース3Dがんモデルは、がん研究、創薬、個別化医療において非常に価値の高いツールです。一次腫瘍由来モデルは、腫瘍の不均一性や形態、複雑な遺伝的・分子構成を再現できるため、創薬や薬剤試験を加速します。しかし、3Dアッセイの実施は複雑であり、化合物スクリーニングのための方法の採用において障壁となっています。

本研究では、複雑な3D細胞ベースアッセイをスケールアップ可能にするイメージングおよび細胞培養の自動化について説明します。私たちは、ImageXpress Confocal HT.aiハイコンテントイメージングシステム、自動CO₂インキュベーター、自動液体ハンドラー（Biomek i7）、および協働ロボットを含む統合ワークセルを開発しました。ワークセルのプロトコール設定により、化合物試験、培養モニタリング、薬剤の表現型効果の評価をハイコンテントイメージングで自動化できます。腫瘍オルガノイドは、トリプルネガティブ乳がんサブタイプを示す転化型乳がんである患者由来腫瘍切片TU-BcX-4ICから分離した一次細胞から形成しました。化合物とのインキュベーション中、腫瘍オルガノイドは透過光イメージングで毎日モニタリングされ、機械学習ベースの画像解析により、サイズ、直径、完全性、光学密度の特徴付けが可能になりました。エンドポイントアッセイでは、腫瘍オルガノイドを生存率染色し、自動共焦点イメージングシステムで撮像しました。さらに、腫瘍の表現型や化合物の効果を研究するために使用できる複数の定量的記述子を特徴付けました。これには、サイズと完全性、細胞形態と生存率の評価、さまざまな細胞マーカーの存在と発現レベルの決定が含まれます。

本稿では、3Dがんアッセイおよび化合物スクリーニングにおけるスループットと自動化を向上させる方法とツールを紹介します。さらに、複雑な細胞システム、疾患表現型、化合物効果に関するより多くの情報を科学者が得られる高度な解析手法と記述子を示します。

方法

細胞培養

腫瘍オルガノイドおよびPDXオルガノイド（PDXO）の生成方法は、以前に報告されています（Matossianら、2021）。一次腫瘍サンプルはSCID/Beigeマウスに移植され、急速な腫瘍増殖を示し、14日で最大腫瘍体積 >1000 mm³ に達しました。その後、そのサンプルから2D培養で増殖可能な細胞株が作製されました。腫瘍オルガノイドは、2Dで増殖させた4IC細胞から形成しました。4IC細胞をU字型低接着384ウェルプレート（Corning）に約2,000 cells/wellで分注し、48時間インキュベートして緊密な腫瘍オルガノイドを形成しました。4IC細胞は、グルコース、NEAA、2mMグルタミン、インスリン120μg/L、10% FBS（Gibco 12491-015）を補充したAdvanced DMEMで培養しました。代謝アッセイでは、腫瘍オルガノイドをDMEM + 10%透析血清（2mMグルタミン、5mMグルコース、フェノールレッドなし）で培養しました。。

細胞モニタリングとイメージング

透過光（TL）または蛍光画像は、ImageXpress Confocal HT.ai ハイコンテントイメージングシステム（モレキュラーデバイス）を用いて、MetaXpress ハイコンテント画像解析ソフトウェアで取得しました。腫瘍オルガノイド画像は、約60μmのオフセットでTL撮像しました。Zスタック画像は、共焦点モードで10Xまたは20X対物レンズを使用して取得しました。解析にはMetaXpressまたはIN Carta™画像解析ソフトウェアを使用しました。

細胞培養とイメージングプロトコールの自動化

オルガノイドの自動イメージングと解析は、オルガノイドの表現型変化を定量的に評価し、実験や試験のスループットを向上させるために重要です。私たちは、オルガノイドや幹細胞の成長と分化の自動モニタリング、維持、特徴付け、さらにさまざまな化合物の効果を試験できる自動統合システムを構築しました。この自動システムには、ImageXpress Confocal HT.aiシステムと解析ソフトウェア、自動CO₂インキュベーター、Biomek i7液体ハンドラー、協働ロボット、レールが含まれます。ロボット自動化はGreen Button Goソリューションによって実現しました。

研究成果

3D腫瘍オルガノイドの培養とイメージング

3D腫瘍オルガノイド培養は、一次トリプルネガティブ腫瘍から開始しました（メソッド参照）。細胞株は、一次組織をSCIDマウスで継代し、その後2D細胞培養に適応させて開発しました。腫瘍オルガノイドは、384ウェル低接着プレートで2,000細胞を48時間培養して形成し、その後、NCI（米国国立がん研究所）の承認済み抗がん薬ライブラリーから化合物を処理しました。試験には5種類の濃度を使用しました。

細胞培養、化合物処理、イメージングの自動化

Biomekによる自動化を用いて、化合物の希釈、細胞処理、染色を行いました。その後、腫瘍オルガノイドは自動イメージングで毎日モニタリングしました。腫瘍オルガノイドの表現型、密度、サイズはAIベースの画像解析により自動的に検出・特徴付けされました。エンドポイントアッセイでは、Hoechst、calcein AM、EtHDの組み合わせで細胞を染色し、複雑な表現型解析のためにCustom Module Editorを使用して解析しました。

NCIライブラリーからメタプラスティック型トリプルネガティブ乳がん腫瘍オルガノイドを標的とする化合物の同定

3D腫瘍オルガノイド培養は、疾患モデル化や化合物効果の評価に非常に有用なツールです。自動化されたワークフローにより、化合物スクリーニングのためのアッセイをスケールアップし、再現性と操作性を向上できます。腫瘍オルガノイドの自動イメージングと解析は、表現型変化の定量的評価や生物学的応答の複雑性のモニタリングに重要です。イメージングから得られる複数のリードアウトには、腫瘍オルガノイドのサイズ、完全性（面積）、異なるマーカーの蛍光強度、セルカウントおよび特徴付けが含まれます。

168種類の化合物をNCIライブラリーから選び、10倍希釈で5種類の濃度（10nM、100nM、1000nM（1µM）、10µM、100µM）で試験しました。その後、腫瘍オルガノイドの完全性（面積）と生存率（生細胞の割合）を評価し、濃度ごとのヒット化合物を同定しました。従来のがん治療に耐性を示す腫瘍サブタイプを標的とする効果を示した薬剤が複数確認されました。以下の薬剤は、指定濃度で腫瘍オルガノイドの表現型に効果を示しました（高濃度では低濃度で示されたものも含まれます）。

指定濃度で効果を示した化合物リスト：

選択化合物の用量反応および二次解析

選択された化合物のサブセットを二次解析に用いました。化合物は1〜10000nMの範囲で7種類の濃度で試験しました。EC₅₀値は腫瘍オルガノイドの崩壊測定を用いて決定しました。

結論

• 本研究では、一次トリプルネガティブ転化型がん細胞サンプル由来の3D腫瘍オルガノイドを用いた化合物スクリーニングアッセイを実証しました。NCIライブラリーから168種類の化合物を複数濃度で試験し、3D細胞アッセイで有効性を示す化合物を複数同定しました。
• 腫瘍オルガノイドアッセイと化合物処理のプロセスは、自動イメージングシステム、液体ハンドラー、自動インキュベーター、協働ロボットを統合することで自動化しました。これらの装置により、がん生物学における化合物スクリーニングに使用できる3D細胞モデルの自動培養、維持、化合物処理が可能になりました。
• ハイコンテントイメージングと3D解析の組み合わせにより、オルガノイドの細胞内容の複雑かつ定量的な解析、異なる表現型を持つ細胞のカウントや測定が可能になります。この方法は、抗がん化合物の効果試験や疾患モデル化に利用できます。