Application Note 異方性によるビーズ結合
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はじめに
蛍光偏光の異方性を測定することは、生体分子の局所環境を特徴付ける強力なツールです。異方性は、励起から発光までの分子の回転を測定するもので、分子量、結合状態、粘性、励起と発光の双極子間のアライメントや固有異方性など、多くの要因に影響されます。異方性パラメータrは、Iが平行強度、Iが垂直強度である場合、次式に従って計算されます：
蛍光偏光（FP）アッセイは、バルク溶液中の蛍光体の有効質量の変化を測定するために長い間使用されてきました。典型的なアッセイでは、蛍光色素と結合した化合物がより大きな分子に結合することで、そのFPや異方性が変化します。ImageXpress®ベロスシステムは、従来の溶液アッセイだけでなく、ビーズや細胞結合アッセイでも対物レンズベースの異方性測定が可能です。
このアプリケーションノートでは、ビオチン化Alexa FluorTM 488色素（b-AF488、Molecular Probes社製）、ステプタビジン（SA）タンパク質（Prozyme社製）、SAコート10μmポリスチレンビーズ（Spherotech社製）のモデル系を用いたビーズ結合アッセイの性能データを紹介します。アッセイはガラス底384ウェルプレート（Matrical）で行い、488nmレーザーでスキャンしました。 b-AF488のEmissionは、510-540nm BPフィルター（Omega）を装着した光電子増倍管（PMT）を用いて測定しました。励起レーザーに平行に偏光したEmissionを収集するチャンネル（Para）と励起レーザーに垂直に偏光したEmissionを収集するチャンネル（Perp）の2チャンネルを測定しました。すべてのデータは、BlueImage解析プログラムとExcelTM（Microsoft）を用いて解析しました。
Resuts - バルクソリューション
バルク溶液を用いたImageXpress Velosシステムの性能は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のb-AF488の異方性と、PBS中のb-AF488＋SAの2つの混合物を比較することにより測定しました。サンプルを下表に示す：
| サンプル名 | b-AF488 | SA量 |
|---|---|---|
| 色素 | 40 µl of 5 nM | なし |
| 色素 + 1x SA | 40 µl of 5 nM | 4 µl of 10 µg/m |
| 染料 + 5x SA | 40 µl of 5 nM | 4 µl of 50 µg/ml |
図1. 遊離b-AF488の異方性の比較 図1. PBS溶液中のSAに結合したb-AF488色素と遊離のb-AF488色素の異方性の比較。 PBS溶液中のSAに結合したb-AF488色素と遊離のb-AF488色素の異方性の比較。
シングルウェルでの測定は15分間に7回繰り返しました。PBS溶液中のb-AF488の異方性は、0.018という値に内部標準化されました。最初の2つの溶液の7回の繰り返しにおける平均rのプロットを図1に示します。エラーバーは測定値の1標準偏差を表します。2番目の溶液と3番目の溶液の間に変化は見られず、結合の飽和を示しています。予想されたように、低分子量の色素分子は高分子量のSAと結合すると異方性が増加しました。2つの状態間の優れた区別が観察されました。
結果 - ビーズ結合
b-AF488の異方性に対する結合の影響を示すため、SAコーティングビーズの1:200溶液20 µlを1つのウェルに分注しました（図2参照）。サンプルをスキャンしてバックグラウンドシグナルを得ました。ポリスチレンビーズの自家蛍光が若干見られました。
図2. 384ウェルプレート中のビーズ＋色素の画像
その後、10nM b-AF488を20μl添加し、10分間の時間経過で7回の測定を行いました。ビーズの蛍光強度と異方性は、BlueImageで閾値処理を行い、ビーズ特異性データを抽出し、ビーズ集団の平均パラメータを計算することで測定しました。ウェル画像の視野内で約70個のビーズを測定し、残りのピクセルからパラメータを計算しました。両ビーズの蛍光強度データ
図3. PBS溶液中におけるSAコートビーズへのb-AF488の結合に関する蛍光強度の時間経過。
および色素をParaおよびPerpチャンネルで測定した結果を図3に示します。ビーズ強度は6～8分の時間経過で着実に増加し、その後飽和します。これは、b-AF488色素がSAコートビーズに結合していることと一致します。SAコートビーズに結合した後、色素濃度が低下するため、色素シグナルがわずかに減少することが示されています。必要であれば、データから結合率を計算し、初期色素濃度の測定値を得ることができます。異方性を点で計算し、その平均値を図4に示します。結合した染料の異方性は内部標準化で0.18、溶液中の染料は0.018としました。ビーズのデータポイントのエラーバーは、ビーズの平均値の1標準偏差を表します。
図4. SAコートビーズに結合したb-AF488（ビーズ）とPBS溶液中で色素を含まないb-AF488（色素）の蛍光異方性。データは図2に示した時間経過にわたって取得しました。
各時点でのビーズ集団。測定された結合色素の異方性は、経時的に非常に安定しており、結合した蛍光色素の微小環境は変化していないことがわかりました。個々のウェルにおけるビーズの異方性を384ウェルプレート全体で測定し、ImageXpress Velosシステムの能力を評価しました。ウェルあたり約100個のビーズを分析し、平均異方性値を算出しました。この分析結果を図 5 に示します。優れたばらつきが観察され、フルプレートのCVは1.5でした。
図 5. フルプレートでのImageXpress Velosシステムの異方性変動。
結論
これらの結果は、ImageXpress Velos システムが、対物レンズの異方性と同様に、バルク溶液の異方性の変化を測定できることを示しています。異方性の変化に基づくアッセイは、このプラットフォームによって可能になります。さらに、異方性をゲーティングパラメーターとして使用することで、より標準的な蛍光強度アッセイのロバスト性を高めることができます。カイネティックレートを決定するための時間経過測定もImageXpress Velosシステムで可能です。細胞の異方性測定は、FRETベースのアッセイだけでなく、膜結合やトランスロケーションのアッセイを可能にするために開発中です。このプラットフォームのユニークな光学系とスキャニングエンジンは、アカデミックなスクリーニングとバイオテクノロジーのスクリーニングの両方のニーズを満たすシンプルな「プラグアンドプレイ」アプリケーションを可能にします。
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