Application Note 異方性によるビーズ結合
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はじめに
蛍光偏光の異方性を測定することは、生体分子の局所環境を特徴付ける強力なツールである。異方性は、励起から発光までの分子の回転を測定するもので、分子量、結合状態、粘性、励起と発光の双極子間のアライメントや固有異方性など、多くの要因に影響される。異方性パラメータrは、Iが平行強度、Iが垂直強度である場合、次式に従って計算される：
蛍光偏光（FP）アッセイは、バルク溶液中の蛍光体の有効質量の変化を測定するために長い間使用されてきた。典型的なアッセイでは、蛍光色素と結合した化合物がより大きな分子に結合することで、そのFPや異方性が変化します。ImageXpress®ベロスシステムは、従来の溶液アッセイだけでなく、ビーズや細胞結合アッセイでも対物レンズベースの異方性測定が可能です。
このアプリケーションノートでは、ビオチン化Alexa FluorTM 488色素（b-AF488、Molecular Probes社製）、ステプタビジン（SA）タンパク質（Prozyme社製）、SAコート10μmポリスチレンビーズ（Spherotech社製）のモデル系を用いたビーズ結合アッセイの性能データを紹介する。アッセイはガラス底384ウェルプレート（Matrical）で行い、488nmレーザーでスキャンした。 b-AF488のEmissionは、510-540nm BPフィルター（Omega）を装着した光電子増倍管（PMT）を用いて測定した。励起レーザーに平行に偏光したEmissionを収集するチャンネル（Para）と励起レーザーに垂直に偏光したEmissionを収集するチャンネル（Perp）の2チャンネルを測定した。すべてのデータは、BlueImage解析プログラムとExcelTM（Microsoft）を用いて解析した。
Resuts - バルクソリューション
バルク溶液を用いたImageXpress Velosシステムの性能は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のb-AF488の異方性と、PBS中のb-AF488＋SAの2つの混合物を比較することにより測定した。サンプルを下表に示す：
| サンプル名 | b-AF488 | SA量 |
|---|---|---|
| 色素 | 40 µl of 5 nM | なし |
| 色素 + 1x SA | 40 µl of 5 nM | 4 µl of 10 µg/m |
| 染料 + 5x SA | 40 µl of 5 nM | 4 µl of 50 µg/ml |
図1. 遊離b-AF488の異方性の比較 図1. PBS溶液中のSAに結合したb-AF488色素と遊離のb-AF488色素の異方性の比較。 PBS溶液中のSAに結合したb-AF488色素と遊離のb-AF488色素の異方性の比較。
シングルウェルでの測定は15分間に7回繰り返した。PBS溶液中のb-AF488の異方性は、0.018という値に内部標準化された。最初の2つの溶液の7回の繰り返しにおける平均rのプロットを図1に示す。エラーバーは測定値の1標準偏差を表す。2番目の溶液と3番目の溶液の間に変化は見られず、結合の飽和を示している。予想されたように、低分子量の色素分子は高分子量のSAと結合すると異方性が増加した。2つの状態間の優れた区別が観察された。
結果 - ビーズ結合
b-AF488の異方性に対する結合の影響を示すため、SAコーティングビーズの1:200溶液20 µlを1つのウェルに分注した（図2参照）。サンプルをスキャンしてバックグラウンドシグナルを得た。ポリスチレンビーズの自家蛍光が若干見られた。
図2. 384ウェルプレート中のビーズ＋色素の画像
が観察された。その後、10nM b-AF488を20μl添加し、10分間の時間経過で7回の測定を行った。ビーズの蛍光強度と異方性は、BlueImageで閾値処理を行い、ビーズ特異性データを抽出し、ビーズ集団の平均パラメータを計算することで測定した。ウェル画像の視野内で約70個のビーズを測定し、残りのピクセルからパラメータを計算した。両ビーズの蛍光強度データ
図3. PBS溶液中におけるSAコートビーズへのb-AF488の結合に関する蛍光強度の時間経過。
および色素をParaおよびPerpチャンネルで測定した結果を図3に示す。ビーズ強度は6～8分の時間経過で着実に増加し、その後飽和する。これは、b-AF488色素がSAコートビーズに結合していることと一致する。SAコートビーズに結合した後、色素濃度が低下するため、色素シグナルがわずかに減少することが示されている。必要であれば、データから結合率を計算し、初期色素濃度の測定値を得ることができる。異方性を点で計算し、その平均値を図4に示す。結合した染料の異方性は内部標準化で0.18、溶液中の染料は0.018とした。ビーズのデータポイントのエラーバーは、ビーズの平均値の1標準偏差を表す。
図4. SAコートビーズに結合したb-AF488（ビーズ）とPBS溶液中で色素を含まないb-AF488（色素）の蛍光異方性。データは図2に示した時間経過にわたって取得した。
各時点でのビーズ集団。測定された結合色素の異方性は、経時的に非常に安定しており、結合した蛍光色素の微小環境は変化していないことがわかった。個々のウェルにおけるビーズの異方性を384ウェルプレート全体で測定し、ImageXpress Velosシステムの能力を評価した。ウェルあたり約100個のビーズを分析し、平均異方性値を算出した。この分析結果を図 5 に示します。優れたばらつきが観察され、フルプレートのCVは1.5でした。
図 5. フルプレートでのImageXpress Velosシステムの異方性変動。
結論
これらの結果は、ImageXpress Velos システムが、対物レンズの異方性と同様に、バルク溶液の異方性の変化を測定できることを示している。異方性の変化に基づくアッセイは、このプラットフォームによって可能になる。さらに、異方性をゲーティングパラメーターとして使用することで、より標準的な蛍光強度アッセイのロバスト性を高めることができる。カイネティックレートを決定するための時間経過測定もImageXpress Velosシステムで可能です。細胞の異方性測定は、FRETベースのアッセイだけでなく、膜結合やトランスロケーションのアッセイを可能にするために開発中である。このプラットフォームのユニークな光学系とスキャニングエンジンは、アカデミックなスクリーニングとバイオテクノロジーのスクリーニングの両方のニーズを満たすシンプルな「プラグアンドプレイ」アプリケーションを可能にします。
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