Application Note in vitro神経毒性研究および薬剤スクリーニングのための
カルシウム流動アッセイ

はじめに

Marcela Laukova, PhD and Michael P. Shakarjian, PhD｜ニューヨーク医科大学健康科学・実践学部公衆衛生学科環境健康科学部門｜ニューヨーク州ヴァルハラ
キャシー・オルセン博士｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス社

神経細胞は中枢神経系や末梢神経系に存在する電気的に励起可能なセルであり、電気的・化学的シグナルを通じて情報を処理・伝達する。これらの信号は、ニューロンが互いに接続してニューロン・ネットワークを形成するシナプスを介して発生する。

カルシウムイオンは、哺乳類の神経細胞において必須の細胞内メッセンジャーとして機能し、主要な神経細胞機能を制御する多数の細胞内シグナルを生成する。シナプス前末端では、カルシウムの流入が神経伝達物質を含むシナプス小胞のエキソサイトーシスを誘発し、シナプス後では、樹状突起スパインのカルシウムレベルの一時的上昇が、活動に依存したシナプス可塑性の誘導に不可欠である。細胞内カルシウムシグナルは、マイクロ秒スケールの神経伝達物質放出から、数分から数時間にわたる遺伝子転写まで、広い時間範囲にわたって作用するプロセスを制御する。

細胞膜には複数のカルシウム透過性チャネル（電位依存性カルシウムチャネルや、NMDA受容体、AMPA受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体などのリガンド作動性チャネル）が存在し、生理的条件下で神経細胞内のカルシウムフラックスを微調整している。様々な受容体やその作動薬が、健康状態や疾患において神経細胞機能の重要な調節因子であるカルシウムをどのように変化させるかを理解することは、主に神経毒性研究や医薬品開発において、新規の化学修飾剤の開発に貢献する。

カルシウムイメージング、すなわち細胞内カルシウムの変化をモニターすることは、機能する神経細胞においてカルシウムイオンが果たす様々な役割を調べる上で非常に有用な技術である。神経細胞ネットワーク内のダイナミックなカルシウムフラックスを直接測定することで、神経細胞が細胞外からのシグナルをどのように処理しているかが明らかになる。例えば、神経伝達物質の添加や、細胞内カルシウムレベルの変化を引き起こす薬理学的薬剤に対する反応などが挙げられる。

ここでは、EarlyTox™心毒性キットとFlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダーを組み合わせて、マイクロプレートフォーマットでラット初代皮質ニューロンの細胞内カルシウムフラックスを測定し、カルシウム動態をリアルタイムでモニタリングできる化合物ハンドリングが可能であることを実証します。SoftMax® Proソフトウェアは、より正確な神経毒性試験、ひいては医薬品開発に必要なシグナルの定量化を提供します。SoftMax Proソフトウェアでは、Peak Pro解析アルゴリズムにより、ピークカウント、ピーク周波数、ピーク振幅、ピーク幅、ピーク立ち上がり時間、ピーク減衰時間、ピーク間隔など、さまざまなピーク属性を計算できます（図1）。

このアッセイの実行可能性を実証するために、テトラメチレンジスルホテトラミン（テトラミン、TETS、本明細書ではTMDT）を使用しました。TMDTの作用には、GABAAチャネルを介した塩化物イオン侵入の遮断が含まれ、偏光解消、神経細胞へのカルシウムの過剰流入、興奮毒性を引き起こし、難治性てんかん状態を伴う発作、心臓異常、昏睡、死に至る。現在のところ特異的な解毒剤は存在せず、最適な対策を発見するためのエビデンスに基づく体系的なアプローチも欠如している。そこで我々は、TMDTや他の類似薬剤に対する潜在的な解毒剤を迅速に同定するために、一次皮質ニューロンを用いた有効なin vitroスクリーニング法を開発した。

ここでは、他の薬剤の中でもケタミンがTMDTによる細胞内カルシウムの増加を効果的に逆転させ、その結果、この薬剤の神経毒性作用を防ぐことができることを実証した。これらのin vitroデータは、ケタミンがTMDTによって誘発された致死的な発作と死亡からマウスを用量依存的に救済する可能性を示した、マウスモデルにおけるわれわれの以前の観察結果を裏付けるものである（Shakarjian et al.） このアッセイは、解毒剤の同定だけでなく、細胞内カルシウム調節に関与する未知の薬剤の特性解析において、動物実験に代わる信頼性が高く費用対効果の高いin vitroアッセイである。

方法

初代大脳皮質神経細胞培養の準備

妊娠18日目の妊娠ラット1頭から初代皮質ニューロンを単離した。現地で承認された倫理的プロトコールに従い、雌ラットを犠牲にした。子宮全体を解剖し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を入れたシャーレに入れた。胚を子宮から取り出し、無菌状態の組織培養フード内で、冷PBSを封じ込め た別のシャーレに移した。

個々の胚の頭部を小さなはさみで取り除き、新鮮な冷たいPBSの入った別のシャーレに移した。小さな鉗子を用いて頭部を固定し、他の鉗子を用いて脳組織を傷つけることなく注意深く頭蓋骨を開いた。その後、嗅球の一部を失いながら、脳を頭蓋骨から引き離した。小脳と残りの嗅球がそれぞれの脳から取り出された。

個々の脳をペトリ皿の滅菌PBSに移した。倍率を約1.8倍に設定した解剖スコープの下で、各脳を背側に向けた。大脳半球を少し引き離し、切断して分離した。片方の半球を内側（平らな）面が上になるように回転させ、2本の鉗子（#55）を使って半球から髄膜を剥がした。片方の鉗子で半球を固定し、もう片方の鉗子で海馬の周囲を切り取った。最後に脳幹を取り除き、大脳皮質を残した。この手順をもう一方の半球でも繰り返した。

すべての大脳皮質が回収され（任意：海馬は初代海馬培養や他の用途に使用できる）、PBSに浸したまま約1mmに切断された。7.5％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）添加DMEM 1mLとニューロバサル完全培地（2％無血清B27サプリメント、0.5mM GlutaMax-Iおよび10μg/mLゲンタマイシンを含むニューロバサル培地）1mLからなる培地約2mLをミンチに加えた。

直径の異なる3本のガラス製ピペット（小、中、大）を用い、開口部の大きいピペットから開口部の小さいピペットへと、1ピペットあたり10～12回のトリチュレーションを行い、組織を穏やかに解離させた。組織が完全に解離したら、プレーンDMEMを細胞懸濁液に加え、全量を約10mLにした。懸濁液を300g、4℃で5分間遠心した。培地（上清）を除去し、ペレットを新鮮なNeurobasal完全培地1 mLに懸濁した。

細胞を血球計数器でカウントし、ポリ-D-リジンでコートした滅菌済み黒壁透明底96ウェルプレートに、1ウェル当たり50,000～80,000細胞を100μLの総容量でプレーティングした。細胞を37℃、5% CO2で1日間インキュベートし、接着させた。1日後、新しいNeurobasal完全培地100μLを各ウェルに加えた。セルを少なくとも10日間培養し、5日ごとに培地の半分を新しい培地と交換した。細胞を毎日観察し、細胞単層の形成、神経突起の伸長、神経細胞ネットワークの形成を確認した。

カルシウムフラックスの測定

試験管内で14日目、初代神経細胞培養におけるベースラインのカルシウムオシレーションは同期ピークとして現れる。セル密度と培養日数が、カルシウムピークの頻度と振幅を決定する主な要因である。このベースラインカルシウムオシレーションパターンは、カ ルシウムチャネルアゴニストやアンタゴニストなど、カ ルシウムフラックスに関与することが知られている化合 物や薬剤を注入すると、通常急速に変化します。FlexStation 3リーダーを用いると、1回のプレート読み 取りで最大3つの化合物の移動が可能であり、1回の実験 で幅広い化合物や薬剤の組み合わせを連続して試 験することができます。

細胞への色素ローディングのため、各ウェルから 100 μLの培地を除去し、各ウェルに100 μLの量を残した。カルシウム感受性色素を封じ込めたEarlyTox心毒性キット作業溶液を製品添付文書に従って調製し、各ウェルに100μLずつ添加した。ニューロンを37℃で少なくとも1時間、暗所でインキュベートした。

供給される間、下方からの蛍光シグナル（490 nm ex/525 nm em）を同時に検出できるようにした。典型的な設定としては、ベースライン読み取りが300秒、その後300秒で第一化合物を添加し、800秒または1100秒で第二化合物を添加する。このアッセイでの総測定時間は1900秒である。使用した特異性設定を表1に示す。アッセイや使用する薬剤によって、注入時間は異なる場合があります。代表的なカイネティックトレースを図2に示す。

表1. FlexStation 3リーダーの設定

この実験では、5分間（300秒）のベースライン測定後、TMDTをニューロンセルに添加した。その後、さまざまな化合物をセルに添加し、TMDTの細胞内カルシウムへの影響を永久的に、あるいは一時的に逆転させることができるかどうかを調べた。いくつかの異なる化合物の代表的なカイネティックのトレースを図3に示す。

結果

10μMで神経細胞に添加したTMDTは、ベースラインと比較して、AUC分析（t検定、p<0.0001）ならびにピーク振幅（t検定、p=<0.0001）によって示されるように、全細胞内カルシウム濃度を確実かつ有意に増加させたが、ピーク周波数は増加させなかった（図4Aおよび4B、点線）。カルシウムオシレーションにおけるTMDT誘発の変化を逆転させる能力において、様々な薬剤が異なる効果を示した（図3に代表的なトレースを示す）。

3つの異なる濃度で使用されたケタミンは、主にピーク振幅を減少させることにより（ANOVA F(3,42)=13.75, p<0.0001, 図4B）、細胞内総カルシウム濃度（AUC, ANOVA F(3,42)=15.66, p<0.0001,図4A）に対するTMDTの効果を逆転させ、用量反応依存性を示した。しかし、ピーク周波数に対する効果は様々で、40μMケタミン添加後に有意な効果が観察された（ANOVA F(3,42)=4.06、p<0.013、図4C）。ここで使用したケタミンの各濃度間には、統計的に有意な差は見られなかった。

結論

細胞内カルシウムは、生理学的および病態生理学的状態において、多くの神経細胞機能の重要なメディエーターである。われわれは、EarlyTox心毒性キットとFLEXstation 3リーダーを用いて、一次皮質ニューロンのカルシウムフラックスを測定することにより、薬理学的薬剤の迅速なスクリーニングが可能となり、神経細胞内のカルシウムフラックスへの潜在的関与の解明に役立つ可能性があることを実証した。さらに、SoftMax Proソフトウェアは、カルシウムカイネティクスのリアルタイム可視化を可能にし、カルシウムフラックスに対する実験化合物の質的影響に関する情報を即座に提供する。このソフトウェアはまた、曲線下面積、ピーク振幅、ピーク周波数など、カルシウムシグナルのいくつかのパラメーターの定量を自動化し、作用メカニズムに関する貴重な情報を提供する。

参考文献

Shakarjian MP, Ali MS, Velíšková J, Stanton PK, Heck DE, Velíšek L. 2012. NMDA受容体とGABA(A)受容体に作用する薬剤によるテトラメチレンジスルホテトラミン誘発発作の異なる拮抗作用。Neurotoxicology. 48:100-8.