Application Note CellXpress.ai 自動細胞培養システムによる、
自動化かつ高再現性な脳オルガノイド生成

Felix Spira, PhD | シニアマネージャー（ハードウェアエンジニアリングおよびアプリケーション） ｜モレキュラーデバイス
Sandra Grund-Gröschke, PhD | 3D アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

はじめに

アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経疾患は、依然として世界的な重大な健康課題となっています。創薬と医薬品開発パイプラインへの多大な投資にもかかわらず、進展は複数のボトルネックによって阻害されてきました。根本的な課題の一つは、化合物スクリーニングやリード化合物の最適化を正確に導くための、信頼性の高い in vitro および in vivo モデルが不足していたことです。従来の細胞株や動物試験を用いたワークフローでは、ヒト脳およびその疾患の複雑性を再現できないことが多くありました。こうした状況は、Lancaster et al.¹ による 2014 年の最初の脳オルガノイドモデルの開発によって大きく変わりました。脳オルガノイドは、ヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）由来の複雑な 3D ミニチュアモデルであり、ヒト脳の一部を模倣しています。従来の 2D 培養とは異なり、脳オルガノイドには複数の細胞種が含まれ、それらが相互作用し、実際の組織の構造やアーキテクチャを再現します。この複雑性により、脳の発生や疾患を研究する上で優れたモデルとなっています。近年、脳オルガノイド生成プロトコールは大きく進展しており、これらのモデルは創薬、疾患モデリング、そして個別化医療における不可欠なツールとして確立されつつあります。²

こうした進展にもかかわらず、脳オルガノイドを創薬に応用するための実用化には、再現性の低さや、スケールアップを妨げる複雑で労働集約的なプロトコルといった課題が依然として存在しています。誘導多能性幹細胞（iPSC）から脳オルガノイドへ分化させるプロトコルはモデル系によって異なるものの、一般的に数か月にわたる培地交換と継続的なモニタリングを必要とします。この長期に及ぶ培養工程は、ウェル間およびプレート間の高いばらつきにつながり、依然として大きな制約となっています。

CellXpress.ai自動細胞培養システム は、これらの課題を克服するために設計されています。本システムは、液体ハンドラー、イメージャー、インキュベーターを統合したプラットフォームであり、2D および 3D の細胞培養における播種、給餌、継代、モニタリングを可能にします（画像 1 および 2）。

CellXpress.ai の液体ハンドリング工程を最適化することで、ばらつきを低減し、コンタミネーションリスクを抑えるとともに、培地吸引・分注時のオルガノイドの損失や損傷を最小限に抑えることが可能です。システムに搭載された “Smart Media Module” は、複数日間にわたるオンデッキでの試薬保管を可能にすることで、ハンズオフ時間を大幅に向上させます。さらに、これらのメディアモジュールは、給餌開始時に培地が所定の温度に達しているよう事前に加温し、すべてのプレート処理が完了するまでその温度を維持します。給餌後には、オンデッキでの培地保管のために自動的に冷却が行われます（画像 1）。また、メディアコンテナに加えて、リザーバープレートもオンデッキに保管することが可能です。

CellXpress.ai Automated Cell Culture System は、ロッキング式インキュベーターを統合することで、脳オルガノイドのような浮遊型オルガノイドの培養を可能にします。このロッキング式インキュベーターは、成熟プロセス全体を通して培地を継続的に撹拌できる点が特徴です。また、最大 6 枚のラックを収容でき、静置条件とロッキング条件を組み合わせた構成が可能です。これにより、幹細胞と脳オルガノイドを同一インキュベーター内で培養することができます。この機能は、脳オルガノイド生成プロセス全体をエンドツーエンドで実行するための重要な要素となります。さらに、CellXpress.ai システムは内蔵イメージャーによる培養の継続的なモニタリングを可能にし、IN Carta 画像解析ソフトウェアを組み込むことで、機械学習を活用した画像解析を行うことができます。

本アプリケーションノートでは、CellXpress.ai システムを用いた自動化脳オルガノイド生成ワークフローについて、iPSC から複雑な脳オルガノイドへの分化・成熟までの一連の工程を説明いたします（画像 2）。幹細胞培養においては、単一細胞継代法およびフラグメント継代法を確立しました。幹細胞を脳オルガノイドへ分化させる際には、出発材料の品質が極めて重要であり、幹細胞は健常で未分化のコロニーを示している必要があります。幹細胞品質を管理するため、IN Carta image analysis software を導入し、高度な人工知能を活用したコロニーセグメンテーションにより、健常コロニーと分化コロニーを識別できるようにしました。
また、従来一般的に使用されてきたオービタルシェーカーではなく、ロッカーを用いて脳オルガノイドを生成するワークフローを構築しました。オルガノイドの品質は、機能アッセイおよび全マウント染色により評価しました。さらに、CellXpress.ai システムのバックポートを利用することで、ImageXpress® Confocal HT.ai High Content Imaging System などの外部デバイスをシームレスに統合し、高度なモニタリングを実現できることも示しました。

方法

iPSC の培養

ヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）株 WTC-11（Gm25256, Coriell Institute for Medical Research）を用いて脳オルガノイドを作製いたしました。フラグメント継代は、CellXpress.ai Automated Cell Culture System を用いた iPSC の培養、継代、および増幅の自動化に関するアプリケーションノートに記載されたプロトコルに従って実施しました。脳オルガノイドの作製に際しては、iPSC を TrypLE により単一細胞化し、96 ウェル U ボトムプレートへ播種しました。

大脳オルガノイド

大脳オルガノイドの作製には、プロトコールに記載されているとおり、StemCell Technologiesのキット（Catalog #08570）を使用いたしました。成熟工程では、比較のためにプレートをオービタルシェーカーまたはロッカーのいずれかに設置しました。

前脳オルガノイド

前脳オルガノイドは、96ウェル U ボトムプレート（Greiner, Kremsmünster, DE）で作製いたしました。12 日目には、オルガノイドを 6 ウェル超低接着プレート（Greiner, Kremsmünster, DE）へ移すか、あるいは 96 ウェル U ボトムプレートでそのまま培養を継続しました。成熟工程では、比較のためにプレートをオービタルシェーカーまたはロッカーのいずれかに設置しました。

中脳オルガノイド

中脳オルガノイドの作製は、Renner et al.（2021）³ に従って実施いたしました。

画像解析

未分化および分化した iPSC コロニーのセグメンテーションには、機械学習ベースのプロトコールを用いるIN Carta 画像解析ソフトウェアを使用いたしました。画像解析に基づき、プロトコール内に意思決定ルールを設定することで、自動化された iPSC 培養の継代処理と、分化が認められるウェルの除外を可能にしました。

細胞特性解析

iPSCコロニーの品質管理のため、4%パラホルムアルデヒドで固定し、多能性マーカーで染色しました。

脳オルガノイドの機能的活性は、メーカーのプロトコールに従い、FLIPR® Calcium 6 Assay Kit（Molecular Devices）を用いてカルシウムフラックスを評価することで測定しました。

オルガノイドの品質管理のため、Renner et al.⁴ により公開されたプロトコールに従って全体染色を実施しました。概要として、まずオルガノイドをベンジルアルコールおよびベンジルベンゾエートでクリアリングし、クリアリング後に染色を行いました。細胞イメージングシステムは ImageXpress HT.ai system を使用して実施しました

結果

自動化された幹細胞培養

脳オルガノイドを生成するためには、出発材料となる幹細胞の品質が極めて重要であり、高品質な幹細胞が高品質な脳オルガノイドの作製に不可欠です。CellXpress.ai システムを使用することで、ヒト iPSC 培養を複数回の継代にわたり維持することが可能でした。ここでは、細胞数およびコンフルエンシーの継続的な増加により、幹細胞コロニーの一貫した増殖が観察されました（画像 3A）。CellXpress.ai システム上での幹細胞培養においては、単一細胞継代法およびフラグメント継代法を確立しました（画像 3B）。コンフルエンシーが一定の閾値に達した際には、意思決定に基づき自動的に継代を実行できました。

さらに、CellXpress.ai 自動細胞培養システムと IN Carta image analysis software の互換性により、コロニーセグメンテーションに深層学習を導入し、健常な細胞（画像 3C）と分化した細胞（画像 3D）を識別することが可能となりました。これらの確立したプロトコールを用いることで、複数のプレートにわたりヒト iPSC の安定した増殖を確認することができました（画像 3E）。

iPSC の脳オルガノイドへの分化

CellXpress.ai システムのソフトウェアには複数のプロトコールフェーズが備わっており、必要に応じて組み合わせることでプロトコールを構築できます。これらのフェーズには、給餌、イメージング、播種、継代が含まれます。CellXpress.ai システムの各種機能を活用することで、脳オルガノイド生成ワークフローを確立することができました。本プロトコールには、iPSC を 96 ウェル U ボトムプレートへ播種し、96 ウェルおよび 6 ウェルプレートに対して定期的な給餌および画像取得サイクルを行う工程が含まれます（画像 4A）。これにより、CellXpress.ai システムは、オルガノイド発生過程におけるエラーが起こりやすい反復作業を卓越した精度で自動化し、ハンズオフ時間を大幅に増加させます。内蔵イメージャーは 96 ウェルおよび 6 ウェルプレートの迅速かつ全ウェル撮像を可能にし、各オルガノイドを高解像度でモニタリングできます。これにより、オルガノイドのバッディングなどの重要な形態情報を取得できます（画像 4B–C）。

脳オルガノイドを適切に成熟させるためには、オルガノイドを常に動かし続けることが重要です。これらのオルガノイドは非常に高い栄養要求性を持ち、栄養と酸素を絶えず供給する必要があります。標準プロトコールではオービタルシェーカーが使用されますが、その自動化は依然として課題があります。一方、ロッカーを用いた自動化ソリューションも存在します。本研究では、ロッカーで培養したオルガノイドがシェーカーで培養したものと同等であるかを検証しました（画像 4D）。ロッカー上で脳オルガノイドを正常に培養することができ、培養 10 日目頃にはオルガノイド表面のバッディングといった特徴的形態が観察されました（画像 4E）。さらに、48 日間培養後のオルガノイド面積を比較したところ、シェーカーとロッカーの間で差は認められませんでした（画像 4E）。

脳オルガノイドの高解像度画像取得

CellXpress.ai システムの自動化機能と ImageXpress HT.ai システムの高性能イメージング機能を組み合わせることで、脳オルガノイドの高解像度画像取得が可能となりました。ImageXpress HT.ai システムは、異なる倍率においても高い解像度と画像品質を維持し、オルガノイド全体像の把握から領域ごとの詳細観察までを可能にします。これにより、大脳皮質層が明瞭に視認できる画像を取得できます（画像 5A–D）。複数のイメージングモードを組み合わせることで、脳オルガノイド内のニューロンの生存性および機能性を裏付けることができます。

大脳オルガノイドの解析

大脳オルガノイドの機能的活動は、細胞内カルシウム濃度の経時的変化を追跡することで評価しました。この評価には Calcium 6 Assay キットを使用し、カルシウム濃度の変動を指標としてニューロン活動を測定しました。ニューロン活動の測定には ImageXpress HT.ai システムのストリーム取得機能を用い、機能的に活性な脳オルガノイドが形成されていることが明らかになりました（画像 6A–F）。

CellXpress.ai システムによる中脳オルガノイドの生成

CellXpress.ai システムを用いて、中脳オルガノイドの自動化生成ワークフローを確立しました（画像 7A）。中脳オルガノイドの成長は、システムに統合された cell journey 機能により経時的に追跡されました（画像 7B）。品質管理のため、全マウント染色およびカルシウムイメージングを実施しました。
全マウント染色では、光透過性を高めるためにオプティカルクリアリングを行いました（画像 7C）。クリアリング後、蛍光抗体で染色し、高コンテンツイメージングシステム ImageXpress HT.ai を用いて撮像しました。免疫蛍光マーカーによる全マウント染色は、中脳オルガノイドの形態的・表現型的特徴を明瞭に描出する高品質な画像を提供します（画像 7D）。 
さらに、カルシウム染色した中脳オルガノイドをモニタリングし、オルガノイド内の 4 つの異なる領域から選択した単一ニューロンの活動を追跡しました。その結果、中脳オルガノイド全体にわたりニューロンが機能的に活動していることが示されました（画像 7E）。

脳オルガノイドの表現型分類

脳オルガノイドの表現型を理解することは、「良好」なオルガノイドと「不良」なオルガノイドを識別するうえで極めて重要です。これにより、望ましくない表現型を示すオルガノイドを給餌やイメージングなどの後続工程から除外でき、高価な培地や時間の無駄を削減できます。IN Carta ソフトウェアの phenoglyphs ツールは、脳オルガノイドの表現型分類を可能にします（画像 8A）。
分類は手動でも実施できますが、IN Carta ソフトウェアのディープラーニングアルゴリズムを導入することで、このプロセスを大幅に高速化できます。画像 8B の混同行列は、手動で決定した表現型ラベルと自動アノテーション結果が高い一致を示しており、IN Carta 画像解析ソフトウェアが自動化された脳オルガノイド拡大ワークフローにおいて有用であることを示しています。

結論

本アプリケーションノートは、CellXpress.ai 自動細胞培養システムを用いて生成された脳オルガノイドが、手動で作製されたオルガノイドと同等のサイズおよびニューロン活動を示すことを明確に示しています。CellXpress.ai システムは、iPSC ライン、6 ウェルプレート中の浮遊培養脳オルガノイド、96 ウェルプレート中の単一オルガノイドを同時に安定して培養できることが実証されました。
さらに、内蔵イメージングシステムにより、異なるプレートフォーマットやモデル系に対して自動化された画像取得が可能となり、その後、各モデルに最適化されたラベルフリー画像セグメンテーションおよび分類を信頼性高く実行できます。

これらを単一プラットフォーム内で完結できる 完全統合型エンドツーエンドソリューション は、健常な幹細胞から成熟した機能的脳オルガノイドまで、スケーラブルで堅牢かつ高スループットなオルガノイド生成が可能であることを示しています。

参考文献

1. Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc 2014;9(10):2329–2340. ランカスター MA、ノブリッヒ JA。ヒト多能性幹細胞からの大脳オルガノイド生成。Nature Protocols 2014;9(10):2329–2340.
2. Birtele M, Lancaster M, Quadrato G. Modelling human brain development and disease with organoids. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2025;26(5):389–412. ビルテレ M、ランカスター M、クアドラト G。オルガノイドを用いたヒト脳発生と疾患のモデル化。Nature Reviews Molecular Cell Biology 2025;26(5):389–412.
3. Renner H, Grabos M, Schöler HR, Bruder JM. Generation and maintenance of homogeneous human midbrain organoids. Bio-protocol 2021;11(11):e4049–e4049. レンナー H、グラボス M、シェーラー HR、ブルーダー JM。均質なヒト中脳オルガノイドの生成と維持。Bio-protocol 2021;11(11):e4049–e4049.
4. Renner H, Otto M, Grabos M, Schöler HR, Bruder JM. Fluorescence‑based single‑cell analysis of whole‑mount‑stained and cleared microtissues and organoids for high‑throughput screening. Bio-protocol 2021;11(12):e4050–e4050. レンナー H、オットー M、グラボス M、シェーラー HR、ブルーダー JM。高スループットスクリーニングのための、全マウント染色およびクリアリング処理した微小組織・オルガノイドの蛍光ベース単一細胞解析。Bio-protocol 2021;11(12):e4050–e4050.