Application Note SpectraMax Lマイクロプレートルミノメーターを用いた
化学発光VEGF ELISA法
PDF版（英語）
はじめに
Cathy Olsen, Ph.D., Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089 著。
血管内皮増殖因子(VEGFs)は、哺乳類の血管発生や血管の異常増殖を伴う疾患過程に関与している分泌ポリペプチドファミリーである。VEGFは胚発生時に発現され、VEGF対立遺伝子を一つでも欠失させると血管新生が著しく阻害され、胚致死となる。QuantiGlo 化学発光 VEGF イムノアッセイは固相 ELISA で、細胞培養上清、血清、血漿、唾液、尿中の VEGF165 レベルを測定します。定量的サンドイッチ酵素イムノアッセイ法を用い、VEGFに特異的なモノクローナル抗体をマイクロプレートにコートし、標準品と検体をウェルに添加します。さらに洗浄を繰り返し、結合していない抗体-酵素試薬を除去した後、増強ルミノール/ペルオキシド基質をウェルに添加する（図1参照）。(ウェルに最初に結合した VEGF の量に比例して生じる光をマイクロプレートルミノメーターで測定する。アッセイ結果は SpectraMax L マイクロプレートルミノメーターを用いて検出されます。このインストゥルメンテーションはフラッシュとグローの両方のアプリケーションに適しており、96ウェルおよび384ウェルのマイクロプレートフォーマットに対応しています。発光専用の光学設計により、極めて高いS/N比と極めて低いクロストークが得られ、ダイナミックレンジは8桁以上です。SpectraMax®M5/M5eおよびFlexStation®3マルチモードマイクロプレートリーダーの発光モードを使用しても同様の結果が得られます。SoftMax®Proソフトウェアには、データ収集・解析を簡略化するための設定済みプロトコルが含まれています。
材料
- QuantiGlo Human VEGF Immunoassay (R&D Systems P/N QVE00B)。本キットには、標準品、VEGF特異性モノクローナル抗体をプレコートしたマイクロプレートなど、アッセイに必要な全ての試薬と材料が封入されています。
- SpectraMax Lmicroplate ルミノメーター。注：このアッセイはSpectraMax M5/M5 eおよびFlexStation 3multi-modeマイクロプレートリーダーの発光モードでも検出できます。
方法
試薬とスタンダードの調製
ステップ 1. すべての試薬は使用前に室温に戻した。
ステップ 2. 濃縮洗浄液を脱イオン水で10倍に希釈した。
ステップ 3. Glo 試薬 A 1部と Glo 試薬 B 2部をキャップ付きプラスチックチューブに入れて遮光し、使用する 15 分から 4 時間前に作業用 Glo 試薬を調製した。
ステップ 4. VEGF 標準液を 0.5 mL の脱イオン水で希釈し、希釈液を調製する前に穏やかに撹拌しながら最低 15 分間静置した。キャリブレーター希釈液 RD5L でストックスタンダードを 1：10 に連続希釈し、ワーキングスタンダードを調製した。作業用標準液の濃度は 20,000～1.3 pg/mL であった。
測定手順
ステップ 1. 150μLのアッセイ希釈液RD1-8を各ウェルに分注しました。
ステップ 2. 50μLのワーキングスタンダードまたはブランク（キャリブレーター希釈液）を付属のマイクロプレートのトリプリケートウェルにピペッティングした。マイクロプレートを室温で2時間、振とう（500±50rpm推奨）した。
ステップ3. ウェルを吸引し、マルチチャンネルピペッターを用いて 400μL の Wash Buffer で 4 回洗浄した。最後の洗浄後、残りの Wash Buffer を吸引し、プレートを清潔なペーパータオルにブロットした。
ステップ 4. 200μL の VEGF コンジュゲートを各ウェルに添加し、新しい粘着ストリップを貼りました。マイクロプレートを室温で3時間、ステップ2と同様に振盪しながらインキュベートした。
ステップ5. 吸引と洗浄のステップをステップ3と同様に繰り返した。
ステップ6. 各ウェルに100μLのWorking Glo試薬を添加した。マイクロプレートを遮光し、室温で5～20分間インキュベートした。
ステップ7. SpectraMax L マイクロプレートルミノメーターを用いて RLU 値を測定した。インストゥルメンテーションの設定は以下の通り： 1秒の積分時間、AutoRange PMT設定、470nmの標的キャリブレーション波長。
結果
図 1 は SpectraMax Lmicroplate ルミノメーターで上記の設定を用いて得られた VEGF 標準曲線を示しています。このアッセイのダイナミックレンジは 4 桁を超え、バックグラウンドの標準偏差の 3 倍のシグナルを与える濃度から計算した感度は約 1.5 pg/mL であった。これは、R&Dシステムズが主張するキットの平均最小検出可能量3.3 pg/mLとよく相関している。SpectraMax M5およびFlexStation 3マルチモードマイクロプレートリーダーでも同様の結果が得られました（データは示していません）。結果を分析し、SoftMax Proソフトウェアを用いて標準曲線をプロットした。
概要
Quantiglo Human VEGF Immunoassay は、様々な種類のサンプル中の VEGF を測定するための高感度メソッドです。SpectraMax L マイクロプレートルミノメーターと SoftMax Pro ソフトウェアは、このアッセイに優れた感度とダイナミックレンジを提供し、データの取得と解析を簡便化します。
参考文献
- Holmes, David IR and Zachary, Ian (2005). 血管内皮増殖因子（VEGF）ファミリー：健康と疾患における血管新生因子。Genome Biology 6: 209.
- Quantiglo Human VEGF Immunoassay (P/N QVE00B)の添付文書。
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