Application Note MetaXpress透過光解析モジュールによるセルカウント

はじめに

Matthew Hammer｜アプリケーションサイエンティスト｜Molecular Devices

標識不要の細胞アッセイは、細胞数、増殖、健康状態、コンフルエンス、細胞毒性をモニターする多くの生物製剤に必要とされています。このようなアプリケーションでは、効率的でロバストな透過光（TL）イメージングと解析機能が必要であり、細胞を正確にセグメンテーションして定量し、さまざまな細胞の反応や形態を評価する必要がある。さらに、高コントラスト透過光イメージングと蛍光標識およびイメージングの結合は、多くの細胞ベースのアッセイに不可欠です。

MetaXpress® 6.5カスタムモジュールエディター内のTLセルセグメンテーションアルゴリズムは、透過光を用いてイメージングされた細胞の定量化のための最適化可能で信頼性の高い解析アルゴリズムです。このアプリケーションノートでは、透過光の全細胞数と蛍光染色した核数を比較することにより、CHO細胞およびHeLa細胞の解析と定量におけるTL Cell Segmentation Algorithmの有用性と精度を実証します。図1

図1. 透過光で捉えたHeLaとCHO細胞を分析するためのカスタムモジュールのセットアップ。セルはHoechst 33342核色素で染色した。細胞はTLとDAPIフィルターでイメージングし、透過光イメージングと核の蛍光イメージャーに基づいて細胞を解析・定量するようにカスタムモジュールを設定した。

方法

CHOとHeLa細胞の希釈液を96ウェル、黒色、透明底のマイクロプレートにプレーティングした。各細胞タイプの希釈液は6連で行い、細胞は1:2でプレーティングした。プレーティングから24時間後、細胞を37℃、5％CO2インキュベーター内で30分間、Hoechst 33342核色素で染色した。その後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、DPBSで2回洗浄した。細胞をImageXpress® MicroハイコンテントイメージャーシステムとMetaXpress®ソフトウェアで画像化した。1視野を10x Plan Fluor対物レンズで撮像し、最大1500個の細胞を正確に捉えた。画像は透過光とDAPI蛍光チャンネルで撮影され、露光時間はそれぞれ15ミリ秒と35ミリ秒であった。

カスタムモジュールエディターでTL tellセグメンテーションアルゴリズムを設定する。

透過光で撮影したセルの定量化には、正確なセルセグメンテーションが不可欠である。このアルゴリズムが最も正確にセグメンテーションし、HeLa細胞とCHO細胞の両方をマスクするため、TLセル・セグメンテーションにはCell Aが選択された（図2）。セルBやセルCという他の設定もあり、それぞれ小さな細胞や大きな細胞の分析に使用できる。総面積が150 µM2以上でない細胞をフィルタリングするために、モジュールにフィルタリング・マスクを追加した（図3）。これにより、小さく丸められた死細胞が生細胞としてカウント・分析されないようにした。さらに、Nuclei Count Objects Algorithmは、HeLa細胞とCHO細胞の核を正確に定量化するように設定された（図4）。

図2. 選択したHeLa細胞の透過光画像にTLセルセグメンテーションアルゴリズムを適用する。カスタムモジュールエディターで、TLセルセグメンテーションアルゴリズムを設定するには、光源波長と細胞タイプを表す設定を選択します。セルAは、撮像されたHeLa細胞とCHO細胞を最適にマスキングした。

図3. TL細胞セグメンテーション・オーバーレイとフィルターマスク・オーバーレイの比較画像。フィルタリング・マスクは、150 µm2と設定された最小総面積要件に基づいてセルをフィルタリングするよう設定された。

図4. 蛍光核イメージャーのCount Nuclei Objectsセグメンテーション。Count Nuclei Objectsは、Hoechst 33342で染色された核に基づいてセルを定量化するために利用された。すべての核を正確にマスクするために、おおよその最小幅と最大幅、およびローカルバックグラウンド以上の強度のパラメータが最適化された。(左）核は青色、（右）解析マスクは黄色。

透過光でのセル数と蛍光核数との相関性

TLセル・セグメンテーション・アルゴリズムで構成されたカスタム・モジュールは、HeLa細胞とCHO細胞の両方を正確にセグメンテーションした（図6）。透過光の総セル数と核数に統計的な差はなく、TL Cell Segmentation Algorithmの正確さが際立った（図7）。細胞数に加え、TL Cell Segmentation Algorithm（図5）により、細胞反応と形態の異なる特性を評価するための複数の読み出し値の生成が可能になった。例えば、総カウント数、平均カウント数、面積、 強度、積分強度、形状、高さ、幅に加え、細胞や細胞内の対物レンズ など、様々な追加読み出しを生成することができる。真円性死細胞を除外するフィルタリング・マスク（Filter Mask）の使用は、生細胞染色または全細胞染色を使用する必要性を軽減するだけでなく、これをさらに容易にする。さらに、核染色とCount Nuclei Objects Algorithmの使用により、透過光でイメージャーされた細胞内の蛍光標識または染色された物体の分析から、複数の読み出しが可能であることが実証されました。

図5. カスタムモジュールで設定した画像解析マスクを重ねたHeLa細胞の代表画像。青色マスクはTLフィルターマスクを用いたTLセルセグメンテーションアルゴリズムで検出された細胞を表し、黄色はCount Nuclei Objectsアルゴリズムで検出された核を表す。Custom Module で必要な測定は、Measure タブで設定した。対物レンズは TL フィルタリングされたセルセグメンテーションでマスクされたものとして定義され、 Count Nuclei Object マスクは各対物内の Feature を測定するために選択された。

図6. HeLa細胞とCHO細胞のイメージングと、最適化されたTL細胞セグメンテーションカスタムモジュールからの画像解析マスク。(左)DAPI核は青色、(右)透過光中の細胞は水色でマスクされている。画像はImageXpress Microシステムで10x Plan Fluor対物レンズで撮影され、新しいTLセルセグメンテーションアルゴリズムで構成されたカスタムモジュールで解析された。

図7. TL Cell Segmentation and Count Nuclei Objectsモジュールに基づくHeLa細胞とCHO細胞の総細胞数の比較。細胞は1:2に希釈され、ウェルあたり20,000細胞の濃度からスタートした。

結論

MetaXpressのカスタムモジュールエディターのTL Cell Segmentation Algorithmは、複数の細胞タイプとサイズの定量と解析のための効果的なツールを提供する。ImageXpress®マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムによる最適なセグメンテーション機能により、蛍光色素に依存しない形態の解析が可能となる。透過光画像を用いてセルを定量化する機能は、研究者のアッセイ能力に柔軟性を与える。ここで説明する方法は、TL Cell Segmentation Algorithmが、増殖、細胞毒性研究、トランスフェクションを含むがこれらに限定されない複数のアッセイに使用できることを実証している。