Application Note cAMP-Gs HiRange HTRFアッセイを用いた
GPCR活性の検出

はじめに

HTRF®は、Cisbioが開発した生体分子間相互作用を検出するための汎用性の高い技術です。これは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）技術と時間分解（TR）蛍光測定を組み合わせたもので、短寿命のバックグラウンド蛍光を除去することができます。このアッセイでは、結合を調べるタンパク質やその他の生体分子を標識するために、ドナーとアクセプターの蛍光色素を用います。2つの生体分子が互いに結合すると、ドナーとアクセプターは接近します。エネルギー源（フラッシュランプなど）によりドナーが励起されると、アクセプターへのエネルギー移動が起こり、アクセプターは所定の波長で特異的な蛍光を発します。

HTRFは、ドナー・アクセプターTR-FRETペアを形成するために組み合わ せることができる4種類の蛍光色素を用います。ドナーは、ユーロピウムクリプテート（Eu³⁺）とテルビウムクリプテート（Lumi4™-Tb）であり、これらの蛍光は長寿命のため、時間分解蛍光アッセイでの使用が可能です。HTRFアッセイでは、XL665とd2の2種類のアクセプターが開発されています。どちらもHTRFドナーの発光スペクトルと重なる励起スペクトルを持ち、665 nmの発光ピークはドナーが有意に発光しない領域内にあります。オリジナルのHTRFアクセプターであるXL665は、紅藻類から精製されたフィコビリタンパク質色素です。第二世代のアクセプターであるd2は、XL665より100倍小さい修飾アロフィコシアニンであり、XL665ベースのアッセイで起こりうる立体障害の問題を軽減するために開発されました。

HTRF cAMP HiRange キットは、細胞サンプル中のサイクリック AMP（cAMP、環状アデノシン 3'、5'-一リン酸）の定量を可能にします。cAMP は、G タンパク質共役型受容体（GPCR）シグナル伝達における重要なセカンドメッセンジャーです。GPCRにリガンドが結合すると、構造変化が起こり、受容体が活性化され、Gタンパク質が活性化されます。さらなるシグナル伝達は、活性化されるGタンパク質の種類によって異なります。Gタンパク質の活性化は、アデニル酸シクラーゼによるcAMPのアップレギュレーションにつながります。細胞で産生された遊離cAMPは、抗cAMPクリプテートへの結合においてd2標識cAMPと競合するため、細胞内cAMPの増加はFRETの減少につながり、これは665nmで放出される蛍光の減少として検出可能です（図1）。

ここでは、CisbioからHTRF適合の認定を受けたSpectraMax® i3xおよびSpectraMax® iD5マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、GPCR活性の堅牢な無洗浄アッセイを実施する方法をご紹介します。

材料

• cAMP G_s HiRangeキット（1000テスト、Cisbio）
• 白色小容量384ウェルマイクロプレート（Greiner）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス、型番：i3x）
• SpectraMax iD5マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス、型番：iD5）
• SpectraMax i3xプレートリーダー用HTRF検出カートリッジ（モレキュラーデバイス、カタログ番号0200-7011）
• HTRF 検出システム（モレキュラーデバイス、カタログ番号 #6590-0144、Enhanced TRFモジュールおよびHTRFフィルターを含む）、SpectraMax iD5プレートリーダー用

方法

cAMP Gs HiRangeキットはCisbioから提供されました。最終濃度0.17 nM～2800 nMのcAMP標準物質は、キットの添付文書に記載されているとおりに調製しました。cAMPを含まない陽性コントロール（最大FRET）と、cAMPまたはcAMP-d2を含まない陰性コントロールが含まれました。試薬は、表 1 に示すように、低容量 384 ウェルマイクロプレートでウェルあたり 20 μL となるように分注しました。

表 1. 384ウェル低容量プレートのアッセイセットアップ。

プレートに蓋をし、室温で1時間インキュベートしました。時間分解蛍光は、SpectraMax i3x および SpectraMax iD5 プレートリーダーを用い、SoftMax® Pro ソフトウェアで事前に設定したプロトコールを用いて測定しました（装置固有の設定については表 2 および 3 を参照）。SpectraMax i3x および SpectraMax iD5 プレートリーダーでは、アッセイ感度とダイナミックレンジを最適化するため、マイクロプレート最適化およびリードハイト調整の両方が実行されました。

表2. SpectraMax i3x プレートリーダーを用いた HTRF cAMP HiRange アッセイ用に最適化した装置設定。

***表3. SpectraMax iD5 プレートリーダーを用いた HTRF cAMP HiRange アッセイ用に最適化された装置設定。
*HTRF 読み取りには、HTRF 検出システムに含まれる Enhanced TRF モジュールと励起および発光フィルターを取り付ける必要があります。

データ解析

解析は、検出された 2 つの発光波長に基づき、HTRF アッセイ用のCisbio特許のレシオメトリック還元法を用いて行いました。解析ステップを以下に示します。616 nm のドナー発光は内部参照として使用され、665 nm のアクセプター発光はアッセイされる生物学的反応の指標として使用されます。このレシオメトリック測定は、ウェル間のばらつきを低減し、化合物の干渉を排除します。以下のステップ 4 で計算されるデルタ F は、アッセイのバックグラウンドに対するシグナルを反映し、アッセイ間の比較に有用です。結果は665nm/616nmの比から計算され、以下のようにデルタFで表されます：

$$ 1． \text{Ratio} = \frac{\text{Emission}_{665\ \text{nm}}}{\text{Emission}_{616\ \text{nm}}} \times 10^4 $$

$$ 2． \text{Mean ratio} = \frac{\sum \text{ratios}}{n} $$

$$ 3． \text{CV} = \frac{\text{Std deviation}}{\text{Mean ratio}} \times 100 $$

(Ratio_neg=陰性コントロールの比率)

データは、SoftMax Pro ソフトウェアを使用して作成・解析しました。このソフトウェアには、検出と解析を簡素化するために、上記のステップを組み込んだいくつかの事前設定済み HTRF プロトコルが含まれています。

結果

データは上記のように分析され、SoftMax Pro ソフトウェアを用いて 4-parameter curve fitを用いてグラフ化されました（図 2）。表2（SpectraMax i3xプレートリーダー）または表3（SpectraMax iD5プレートリーダー）に示すプレートリーダー設定で最良の結果が得られました。これらの設定は、HTRF 対応リーダーであることを認証するために、Cisbioとの共同研究で最適化されました。遅延時間、積分時間、パルス数を変更すると、最適な結果が得られない場合があります。アッセイ適性はEC₅₀とS/N比を用いて評価され、Cisbioからそれぞれ≦25 nMと≧20であることが示されました。EC₅₀値は両リーダとも非常に類似しており、許容範囲内でした（表4）。SpectraMaxiD5プレートリーダーではS/N比がわずかに改善したが、両リーダーともS/N比は許容範囲を上回り、CV値は6%以下であった。SpectraMax i3x および SpectraMax iD5 プレートリーダーはいずれも、cAMP GsHiRange アッセイにおいて高い感度と広いダイナミックレンジをご提供します。

表4. cAMP HiRange標準曲線の結果のまとめ。

結論

SpectraMax i3x および SpectraMax iD5プレートリーダーは、HTRF 認定の検出カートリッジ（i3x）または HTRF 認定のモジュールとフィルター（iD5）を搭載することができ、HTRF アッセイに要求される厳しい仕様を満たすことができます。どちらのプレートリーダーも、cAMP G_sHiRangeアッセイを実施する能力を発揮し、Cisbioの要求する範囲内の結果を示しました。データ取得と解析は、HTRFプロトコルがあらかじめ設定されたSoftMax Proソフトウェアを用いて簡素化されています。

参考文献

1. http://www.htrf.com/htrf-technology