Application Note 発光イムノアッセイによる
血清サンプル中のSARS-CoV-2 IgGの検出

はじめに

Joyce Itatani | Applications Scientist | Molecular Devices
Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | Molecular Devices

SARS-CoV-2に対する免疫反応の一環として、感染者は症状発現後1～3週間以内に血液中で検出可能なウイルス特異性抗体を産生する。免疫グロブリン-G（IgG）とIgMの両方がほぼ同時に出現し、IgGはより長い期間高いレベルを維持する1, 2。感染やワクチン接種によって血清中に検出抗体が存在すれば、将来の感染から身を守ることができるが、これらの抗体の残存期間や防御の程度は、SARS-CoV-2に関する多くの疑問の1つであり、現在も精力的に研究が続けられている。

ヒト血清中のSARS-CoV-2抗体を検出するイムノアッセイは、ワクチン研究だけでなく、この病気に対する理解を深めるためにも重要なツールです。プロメガLumit™ Dx SARS-CoV-2イムノアッセイは、SmBiTとLgBiTで標識されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質のレセプター結合ドメイン（RBD）のフラグメントを使用します。これらの標識ウイルスタンパク質フラグメントがSARS-CoV-2抗体を封じ込めたサンプルとインキュベートされると、抗体に結合し、SmBiTとLgBiTサブユニットが一緒になって機能的なルシフェラーゼを生成します。Lumit検出試薬を添加すると、発光シグナルが発生し、マイクロプレートルミノメーターで読み取られる。

Lumitアッセイのシンプルな、添加して測定するだけの方式を図1に示す。洗浄工程がなく、1時間以内に結果が得られるため、このアッセイはハイスループットスクリーニングに適しています。SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーと超冷却電子増倍管（PMT）は、Lumit Dx SARS-CoV-2イムノアッセイを高感度に発光検出します。

材料

• Lumit Dx SARS-CoV-2イムノアッセイ (プロメガ社、商品番号VB1080)
• COVID-19陽性血清サンプル (BioIVT cat. #HMSRM-COVID)
• 正常ヒト血清（Amsbio cat.）
• 96ウェル白色マイクロプレート（Greiner cat.）
• SpectraMax iD5マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）

方法

アッセイ試薬を調製し、以下のようにプレートをセットアップした（詳細はLumit Dx SARS-CoV-2イムノアッセイ技術マニュアルを参照）：

1. 45mLのLumit ™ -Dx PBS/EGTAに5mLの10X Lumit-Dxイムノアッセイ希釈バッファーを加えて、1X Lumit-Dxイムノアッセイ希釈バッファーを調製した。
2. COVID-19患者または健常人ドナーからの血清サンプルは、30μLの血清を70μLの1X Lumit-Dxイムノアッセイ希釈バッファーで希釈しました。検体をトリプリケートするのに十分な量が調製された。通常、検体はシングルウェルで測定され、1検体あたり15μLで済む。
3. Lumit-Dx CoV-2 BiTsマスターミックスは、使用直前に以下のものをチューブに入れて調製した： 5 mL の 1X Lumit-Dx イムノアッセイ希釈バッファー、9.4 μL の Lumit-Dx CoV-2 LgBiT（赤キャップ）、9.4 μL の Lumit-Dx CoV-2 SmBiT（青キャップ）。チューブを静かに反転させて混合した。
4. Lumit-Dx 陽性コントロール、Lumit-Dx 陰性コントロール、Lumit-Dx アッセイキャリブレータは使用直前に解凍し、室温に戻した。チューブを短時間遠心し、内容物を底部に集めた。
5. 96ウェル白色プレートに以下を加えた。
   ⚪︎40μLのLumit CoV-2 BiTs Master Mixを全アッセイウェルに添加。
   ⚪︎トリプリケートで希釈した患者血清サンプル20μL
   ⚪︎20μLのLumit-Dx陽性コントロール（トリプリケート
   ⚪︎Lumit-Dx 陰性コントロール（トリプリケート） 20μL
   ⚪︎20μLのLumit-Dxアッセイキャリブレータ（トリプリケート）
6. プレートに蓋をし、室温で20分間インキュベートした。
7. インキュベーション終了後、Lumit-Dx 検出試薬を調製しました。使用直前に 1X Lumit-Dx イムノアッセイバッファー 7 mL と Lumit-Dx 検出基質 230 μL（グレーのキャップ）を合わせてください。チューブを静かに反転させて混合した。
8. 60μLの検出試薬をウェルに加え、プレートを室温で3分間インキュベートした。
9. プレートをSpectraMax iD5リーダーで、表1に示す設定を用いて読み取った。マイクロプレートの読み取り後、相対発光量（RLU）が SoftMax® Pro ソフトウェアのプレートセクションに表示された。プレートのウェルをテンプレート内のグループに割り当て、その結果得られたグループテーブルを用いて結果を計算し、表示した。

表 1. SpectraMax iD5リーダーでのLumit-Dxアッセイのインストゥルメンテーション設定。All Wavelengths設定（波長選択なし）は、リーダーで検出される発光を最大にするために選択した。読み取り高さは、SoftMax ProソフトウェアのRead Height Adjustment設定を使用して、読み取り前に最適化した。

アッセイ品質管理は、キットのテクニカルマニュアルに記載されている方法で評価した。Lumit-Dx アッセイキャリブレータ、Lumit-Dx 陽性コントロール、Lumit-Dx 陰性コン トロールを使用し、アッセイ性能を確認しました。陽性コントロールはアッセイキャリブレーターの RLU より高く、陰性コントロールはアッセイキャリブレーターの RLU より低くなければなりません。これらの条件が満たされない場合、プレートの結果は無効となります。

結果

アッセイ結果は、各試験サンプル（S）の相対光単位（RLU）とアッセイキャリブレーター（C）の平均RLUの比をとることにより算出しました。比（S/C）≧1はSARS-CoV-2抗体陽性、比＜1はSARS-CoV-2抗体陰性であることを示した。アッセイキャリブレーターの平均RLUは548であり、6つのCOVID-19患者サンプルの平均RLUは1787から14,155の範囲であり、健常人ドナーのRLUは86であった。

表2に示すように、COVID-19患者検体の比率はすべて1より大きく、陽性であったのに対し、健常人ドナー検体の比率は1より小さく、陰性であった。

表2. SpectraMax iD5リーダーを用いた患者検体のLumit Dx SARS-CoV-2アッセイ結果。すべてのサンプルとアッセイコントロールはトリプリケートで実施し、CVsを示した。結果は、SoftMax Proソフトウェアを使用して計算および解釈されました。

注：アッセイプレートはSpectraMax i3x、SpectraMax M5、SpectraMax Lリーダーでも読み取り、同様の結果が得られました。

結論

SARS-CoV-2ウイルスに感染した、あるいはワクチン接種を受けた多数の人の検体を調べることで、ウイルスに対する免疫反応のタイミングと持続時間についてより詳しく知ろうとする研究者たちには、大量の血清検体についてSARS-CoV-2抗体を迅速に検査することが必要である。Lumit Dx SARS-CoV-2イムノアッセイは、迅速な結果を得るためのシンプルなワークフローを提供します。SpectraMax iD5リーダーおよびSoftMax® Proソフトウェアと併用することで、計算と結果の解釈が自動化され、少ない作業時間でハイスループットを実現します。