Application Note 自動イメージングによるオートファジーの検出

はじめに

オクサナ・シレンコ｜上級研究員｜モレキュラー・デバイス

薬物療法の有望なターゲットとしてのオートファジー

オートファジーとその制御異常は、神経変性疾患や癌において重要な役割を果たしていることが判明しており、このプロセスに沿った新規治療標的の発見は、薬物療法の有望なアプローチとして浮上している。オートファジーは、細胞ストレスに応答して、損傷したタンパク質や細胞小器官を分解・再利用する制御されたプロセスである1,2。オートファゴソームと呼ばれる小胞は、破壊の対象となる細胞成分の周囲に二重膜を形成することで組み立てられる。

オートファジーは、栄養飢餓への適応、損傷を受けた細胞内タンパク質や細胞小器官の除去、細胞の発生、老化防止、微生物の排除、細胞死、腫瘍抑制、抗原提示など、様々な複雑な生理的・病態生理学的役割を担っている。

材料

• PC12ヒト神経芽細胞腫細胞株（ATCC）
• 384ウェルプレート (Greiner)
• Cyto-ID ® オートファジー検出キット (ENZO Life Sciences)
• オレンジミトコンドリア完全性色素
• ヘキスト33342
• ImageXpress Pico 自動細胞イメージングシステム（Molecular Devices社製）
• CellReporterXpress ™ 画像取得および解析ソフトウェア（Molecular Devices社製）

自動細胞イメージングを用いたオートファゴソーム粒子の検出と定量化

オートファジーへの影響を評価

ここでは、ImageXpress Pico自動細胞イメージングシステムによるオートファゴソーム粒子の検出と定量を評価した。アッセイ開発のモデルとしてPC12ヒト神経芽腫細胞株を用いた。細胞を384ウェルプレートに6,000細胞/ウェルでプレーティングし、48時間培養した。オートファジーへの影響を評価するため、細胞を様々な濃度のクロロキンまたはベラパミルで48時間処理した。ベラパミルはオートファジーを誘導し、クロロキンは粒子の蓄積につながるオートファゴソームの分解を阻害する。処理後、生細胞をCYTO-ID®オートファジー検出キットで染色し、オートファゴソームを追跡した。さらに、ミトコンドリアの検出には蛍光ミトコンドリア色素を、核の識別にはHoechstを用いた（それぞれ0.2μMと1μM）。画像は、ImageXpress Picoシステムを用いて、20倍または40倍の倍率で、適切な色素（それぞれFITC、TRITC、DAPI）用の3つの検出チャンネルを用いて撮影した。20倍の倍率で1ウェルにつき1枚の画像を取得し、40倍の倍率で1ウェルにつき2～4枚の画像を取得し、信頼性の高い統計結果を得た。画像は、CellReporterXpress画像取得・解析ソフトウェアのAutophagyまたはMitochondriaアプリケーションプロトコルを用いて解析した。

このアルゴリズムは、細胞の細胞質内のオートファゴソームやミトコンドリアのような小さな物体を検出し、特徴付ける一方、核マーカーを用いて細胞をセグメント化する。オートファジーを検出するための定量的測定には、顆粒の総数または平均数、顆粒（細胞内物体）の総面積または平均面積、および強度測定が含まれる。クロロキン（30μM）で処理した細胞の代表的イメージングと解析マスクを図1に示す。クロロキンとベラパミルの濃度応答を調べ、EC50値を評価した。クロロキンおよびベラパミルの投与は、総オートファゴソーム数によって決定されるように、オートファジーのレベルをそれぞれ4.6倍および3.3倍増加させた（EC50値はそれぞれ4.0μMおよび3.6μM）。

結論

CYTO-ID色素を用いたこの方法は、オートファジー粒子の検出を可能にし、オートファジーのプロセスに対する化合物の影響のアッセイ開発および定量に用いることができる。

参考文献

1. 水島直樹; 小松正彦 (2011). オートファジー：細胞と組織の再生. セル. 147: 728-41
2. 水島直樹; (2007). オートファジー：そのプロセスと機能, Genes & Dev. 21: 2861-2873
3. Lemasters, J (2005). 酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、老化に対する標的防御としての選択的ミトコンドリアオートファジー（マイトファジー）。若返り研究。8: 3-5