Application Note タグライトHTRF技術による
グルカゴンGLP-1受容体のKdの決定

  • 堅牢な無洗浄飽和結合アッセイの実施
  • シスビオのHTRFツールボックスから入手可能な様々な試薬でアッセイを設定可能
  • HTRFとの互換性が認証されているため、装置の性能を保証します。
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キャロライン・カルドネル｜シニア・アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

はじめに

Cisbio社のTag-lite HTRFプラットフォームは、HTRF蛍光色素で標的部位の目的タンパク質を効率的に標識することができる。細胞表面レセプターをSNAPタグプラスミドに挿入することができる。細胞はこの構築物でトランスフェクションされ、タグ付けされたレセプターを発現する。その後、SNAP-lumi4-Tb-基質を添加することにより、受容体をテルビウム（Tb）クリプテートで共有結合的に標識する。結合アッセイを行うために、レセプターのリガンドをHTRFアクセプター蛍光体、例えばd2で標識する。d2リガンドがテルビウム標識レセプターに結合すると、レセプターからリガンドへの時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（TR-FRET）が、HTRF対応マイクロプレートリーダーを用いて測定できる（図1）。

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図1. Tag-lite細胞表面結合アッセイの例。まず、SNAPタグプラスミドに目的のGPCR遺伝子を挿入する。次に細胞をトランスフェクションし、Tag-lite GPCRを発現させる。次に、GPCRをクリプト酸ドナー（SNAP-lumi4-Tb-substrate）で共有結合的に標識する。最後に、標識リガンドを用いて結合アッセイを行う。

シスビオでは、目的のタグやタンパク質をコードする様々なプラスミド、およびこれらのコンストラクトをすでにトランスフェクトした凍結細胞を提供している。これらのコンストラクトは、受容体リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）をアクセプター蛍光体で標識しながら、テルビウムクリプテートで標識できるタグ付きタンパク質（受容体など）の発現を可能にする。Tag-liteプラットフォームは、受容体の二量化、リガンド結合アッセイ、セカンドメッセンジャーの評価など、幅広いアプリケーションに理想的である。結合速度論は、薬物-タンパク質複合体の会合と解離の速度を研究することを可能にし、薬物候補のin vivoでの有効性を最適化するために必要なステップである1。

グルカゴン様ペプチド-1受容体（GLP1R）は膵β細胞に発現しており、その活性化によってアデニルシクラーゼ経路が刺激され、インスリンの合成と放出が増加する。そのため、GLP1Rは糖尿病治療の標的として期待されている2。GLP1Rは脳にも発現しており、食欲のコントロールに関与しているほか、記憶や学習のメカニズムにも重要な役割を果たす可能性がある。

ここでは、SpectraMax® i3xおよびSpectraMax® iD5マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、HTRFを使用した堅牢な無洗浄飽和結合アッセイを実施する方法を示す。GLP1Rリガンド結合は、HTRF認証済みのSpectraMax i3xおよびiD5リーダーで、Tag-liteテクノロジーを用いて評価した。

飽和結合アッセイ

リガンド結合アッセイは、目的の受容体に対する特定のリガンドの親和性を推定する上で重要であり、リガンドと受容体の相互作用機序を理解する上で極めて重要である。そのため、結合試験は創薬プロセスの一部であり、ターゲットに選択的かつ特異的に結合する薬剤の設計に役立つ。結合親和性は、単一の生体分子（例えば受容体）とそのリガンド（例えば作動薬）との間の結合相互作用を定義する。結合親和性は通常、飽和アッセイで測定され、平衡解離定数（Kd）で表される。Kdは、リガンドとその標的との相互作用の強さを評価し、ランク付けするために用いられる。Kdの値が小さいほど、リガンドの標的に対する結合親和性が高いことを意味する。競合試験や阻害試験においてIC50や阻害定数（Ki）を正確に決定するためには、適切な濃度のリガンドを用いることが不可欠である。通常、Kd値かそれよりもわずかに低い濃度が許容される。Kd値より高い濃度のリガンドを用いると、in vivoでの薬効が低く見えることがある1。

飽和結合アッセイでは、リガンド濃度を増加させながら、全結合と非特異的結合を測定する（図2）。一定量の標識細胞を含む溶液に蛍光リガンドを滴下し、平衡に達するまでインキュベートする。蛍光リガンドがレセプターに結合すると、TR-FRET が起こり、HTRF 認定のマイクロプレートリーダーで測定される。得られたHTRF比は全結合を表す。非特異的結合は、非標識リガンドを用いたネガティブコントロールとして測定され、標識リガンドのレセプター、非レセプター分子、またはマイクロプレートへの非特異的結合を考慮する2。

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図2. Tag-lite 飽和結合アッセイ。全結合測定： 蛍光リガンドが受容体に結合するとTR-FRETが起こる。非特異的結合測定：非標識リガンド（過剰）と蛍光標識リガンドは、標識GPCRへの結合を競合する；非標識リガンドは受容体に結合し、TR-FRETは起こらない。

この測定では、一定量の標識細胞と100倍モル濃度の非標識リガンドを含む溶液に蛍光標識リガンドを滴定する。標識リガンドと非標識リガンドは標識GPCRへの結合を競合する。非特異的リガンドが過剰になると受容体に結合し、TR-FRETは起こらない。この滴定から得られるHTRF比は非特異的結合を表す。特異的結合は、各蛍光標識リガンド濃度における全結合から非特異的結合を差し引くことで算出される。

材料

  • Tag-lite GLP1R 発現、テルビウム標識、凍結保存したそのまま使用可能な細胞 (Cisbio 社製 cat. #C1TT1GLP1)
  • Tag-liteバッファー（Cisbio社製 #LABMED）
  • GLP1受容体レッドアゴニスト（Cisbio cat.）
  • エクセンジン4（Sigma-Aldrich cat.# 1269105）
  • 白色低容量384ウェルマイクロプレート（Greiner cat.#784075）
  • SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社、商品番号i3x）、HTRF検出カートリッジ付き（Molecular Devices社、商品番号0200-7011）
  • SpectraMax iD5マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製、型番#iD5）、HTRF検出システム（Molecular Devices社製、型番#6590-0144）付き。#6590-0144、Enhanced TRFモジュールおよびHTRFフィルターを含む)

メソッド

細胞

細胞は製品添付文書3に従って調製した。凍結細胞を37℃で融解し、5mLの1X Tag-lite buffer (TLB)を含むチューブに移した。チューブを4℃で1200×Gで5分間遠心した。上清を吸引し、細胞ペレットを2.7 mLの1X TLBに懸濁した。

標識（蛍光）リガンド

GLP1 Receptor red agonist は赤色蛍光 HTRF プローブで標識した Exendin 4 誘導体である。400 nM 濃度の red agonist はストック濃度を 1X TLB で希釈して調製した（ストック濃度はキットの添付文書を参照）。その後、1X TLB を用いてさらに 10 回の 1:2 希釈を行い、100 nM から 0.097 nM までの最終濃度を得た。

非標識リガンド

最終濃度40μMの非標識Exendin 4リガンドを、ストック濃度を1X TLBで希釈して調製した（ストック濃度については製品添付文書を参照）。これは最大標識リガンド濃度400 nMの100倍モル過剰に相当する。

アッセイプレートのセットアップ

試薬は Cisbio 社のリガンド結合プロトコールに従って分注した（図 3）。10μLのGLP1受容体細胞を384ウェル白色プレートのウェルに分注した。5μLのTLBを全結合ウェルに添加し、5μLの非標識リガンドを非特異的結合ウェルに添加した。最後に、5μLのGLP1受容体作動薬エキセンディン4-レッドをすべてのウェルに添加した。アッセイプレートは室温（RT）で2時間インキュベートし、SpectraMax i3xおよびiD5リーダーで最適化された装置設定（表1）で読み取った。最適なアッセイ感度とダイナミックレンジを確保するため、マイクロプレートの最適化とリードハイトの調整を行った。

SpectraMax i3x リーダー SpectraMax iD5 リーダー
追加コンポーネントが必要 HTRF 検出カートリッジ： P/N 0200-7011 HTRF検出システム： P/N 6590-0144
励起 340 nm / 80 nm 340 nm / 70 nm
発光 ドナーフィルター： 620 nm

アクセプターフィルター：665 nm 		ドナーフィルター: 616/10 nm

アクセプターフィルター: 665/10 nm
フラッシュ数 30 30
積分遅延時間 30 μs 20 μs
積分時間 400 μs 200 μs
その他の設定 リードハイトは、さまざまな容量やプレート形式に合わせて簡単に最適化できる。

表1 テルビウムドナーと赤色アクセプターを用いたHTRFに使用した装置設定。

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図 3. 384ウェル低容量プレートのアッセイセットアップ。プレートに蓋をし、室温で2時間インキュベートした。TR-FRETはSpectraMax i3xおよびiD5リーダーで測定した（装置設定は表1を参照）。

データ解析

HTRFアッセイの解析には、検出された2つの発光波長に基づくシスビオ特許のレシオメトリック還元法が用いられる。616 nm のドナー発光は内部参照として使用され、665 nm のアクセプター発光はアッセイされる生物学的反応（結合）の指標として使用されます。このレシオメトリック測定（アクセプターとドナーの蛍光の比）により、ウェル間のばらつきを低減し、化合物の干渉を排除します。以下のステップ 4 で算出されるデルタ F は、アッセイのバックグラウンドに対するシグナルを反映し、アッセイ間の比較に有用です。結果は 665 nm と 616 nm の比から計算され、以下のように Delta F で表されます：

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データの作成と解析には、検出と解析を簡略化するためにあらかじめ設定されたHTRFプロトコールが含まれるSoftMax® Proソフトウェアを使用した。

結果

全結合ウェルと非特異的結合ウェルについて、標識リガンド濃度ごとに HTRF 比を測定した。特異的結合は、各蛍光リガンド濃度における全結合から非特異的結合を差し引くことで算出した。データは上記のように解析し、SoftMax Pro ソフトウェアを用いて二直角双曲線フィットを用いてグラフ化した（図4）。表1に示すリーダー設定で最良の結果が得られた。SpectraMax i3xリーダーでは、SpectraMax iD5リーダーで得られたものと同様の飽和曲線（ここには示さない）が得られた。二矩形の双曲線カーブフィットにより、特異的結合飽和曲線上のカーブフィットパラメーターBとしてKdを計算することができる。赤色アクセプターを用いたTag-liteアッセイをマイクロプレートリー ダーで正常に測定できることを確認するため、シスビオ社は5 nM以下のKd値を設定した。Kd値はSpectraMax i3xリーダーで0.816 nM、SpectraMax iD5リーダーで2.347 nMであり（表2）、両装置がこれらのTag-liteアッセイを検出できることが確認された。

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図4. SpectraMax iD5リーダーで測定した飽和結合曲線。飽和結合アッセイでは、平衡状態でリガンド濃度を増加させながら、全結合と非特異的結合を測定する。特異的結合の比率（青色の曲線）は、各濃度における全結合（赤色の曲線）から非特異的結合（緑色の曲線）の比率を差し引いた比率として計算される。

パラメータ シビオの規定値 SpectraMax i3x リーダー SpectraMax iD5 リーダー
K

d

(nM)		 5 0.816 2.34

表 2. Tag-lite結合飽和曲線の結果サマリー。

結論

SpectraMax i3x および iD5 リーダーは、それぞれ HTRF 検出カートリッジまたは Enhanced TRF モジュールとフィルターを装備することができる。どちらのリーダーも、テルビウムドナーと赤色アクセプターの組み合わせからのHTRFシグナルを検出する能力を実証し、Tag-lite技術を用いた飽和研究に使用することができた。データ取得と解析は、HTRF プロトコルがあらかじめ設定された SoftMax Pro 7.0.3（またはそれ以上）ソフトウェアを用いて簡便に行える。

参考文献

  1. https://www.htrf.com/htrf-technology
  2. http://learn.cisbio.com/hubfs/cisbio-ls/docs/application-notes/Determination%20of%20association%20(kon)%20and%20 dissociation%20(koff)%20rates%20constants%20using%20the%20Tag-lite%20platform.pdf?hsCtaTracking=10f4759a-f255-4f21-aa95- b03c24b839e9%7C736c51a4-4301-4256-ab76-a10df00e9593https://cisbio.wistia.com/medias/i2eup2dah5
  3. https://fr.cisbio.eu/media/asset/c/i/cisbio_dd_pi_c1tt1glp1.pdf
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