Application Note ヒト白血病U937細胞による薬剤スクリーニング

Shan Liu, PhD | Product Specialist | モレキュラーデバイス
Rebecca Kreipke, PhD | Field Applications Scientist | モレキュラーデバイス

はじめに

創薬初期段階における増殖抑制および毒性評価のための迅速で信頼性が高く、かつコスト効率の良いハイスループットスクリーニング法は非常に魅力的です。従来の細胞生存率および増殖評価法は、MTTアッセイ *1などの比色法リードアウトを利用してきました。時間の経過とともに、「ワンソリューション」アッセイが開発され、MTS（5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimenthylthiazoly)-3-(4-sulfophenyl) tetrazolium）に基づく方法が登場しました。これはMTTの類似体であり、細胞生存率の指標として紫色の水溶性ホルマザンを生成します。一部の「ワンソリューション」アッセイ（Cell Cytotoxicity Assay-ab112118）は、細胞還元により吸収スペクトルが変化する独自の水溶性色素を使用し、より高い感度と安定性を実現しています。

広く使用されているものの、吸光度ベースの比色細胞毒性アッセイには共通の制限があります。インキュベーション時間や温度などの環境条件に敏感であり、エンドポイントのみのリードアウトしか提供できず、さらに重要なことに、細胞代謝検出試薬に依存する破壊的な方法です。多数の候補化合物を大規模な細胞パネルでスクリーニングするためには、迅速でコスト効率が高く、信頼性のあるシステムが求められており、薬理学研究を大幅に加速させます。

**CloneSelect® Imager（CSI）**は、これらの課題を的確に解決します。CSIは、さまざまなマイクロウェルプレートでウェル全体の画像を非常に高速に取得します（96ウェルプレート全体で90秒）。取得したデータは、Excelスプレッドシートとしてエクスポートしてさらなる解析に使用することも、円グラフのシリーズとして視覚的に表示することもできます。自動細胞検出およびウェルコンフルエンス判定アルゴリズムにより、CSIはラベルフリー、非侵襲的、直接的な細胞増殖解析をリアルタイムで各ウェルに対して提供し、複数のタイムポイントで細胞増殖をモニタリングできます。

従来の比色細胞毒性アッセイとCSIイメージベースのラベルフリー細胞毒性アッセイのワークフロー比較（図1）では、CSIアッセイが検出試薬の使用とインキュベーション時間を排除することで、総アッセイ時間を141分から2分未満に短縮することを示しています。さらに、本研究では、CSIを用いた抗がん薬の細胞毒性および増殖抑制活性評価を実証しました。ヒト単球系U937細胞株 *2という堅牢な細胞モデルを用いて、3種類の抗がん薬（5-フルオロウラシル（5-Fu）*3、シスプラチン、オキサリプラチン *4）の細胞毒性評価をハイスループットスクリーニングで行いました。結果として、CloneSelect Imagerは、ヒト非接着性白血病細胞株U937に対する異なる抗がん薬の細胞毒性を迅速かつ信頼性の高い低コストな方法で決定できることを示しました。

材料と方法

材料と方法

• アッセイキット#2: 細胞毒性アッセイキット (Abcam)
• ヒト単球U937細胞株（ATCC）
• 5-フルオロウラシル (Millipore Sigma)
• シスプラチン（Millipore Sigma）
• オキサリプラチン（Millipore Sigma）
• コーニング96ウェルマイクロプレート（Corning）

アッセイ前の細胞播種

各アッセイが広範囲の生細胞を正確に検出できる能力を検証するため、U937細胞をCorning社製96ウェルマイクロプレートにウェルあたり312～10,000細胞で播種しました。各プレートの最初の列には培地のみ（細胞なし）を含め、データ解析用のブランクコントロールとして設定しました。未処理細胞は、アッセイ前に37°C、5% CO₂で24時間静置・培養しました。

細胞増殖/細胞毒性アッセイ

U937細胞はCorning社製96ウェルマイクロプレートにウェルあたり5,000細胞の密度で播種し、37°C、5% CO₂で24時間培養しました。ウェル間のスペースには100～150 μLの滅菌水を加え、培地の蒸発を最小限に抑え、ウェル間および領域間で均一な熱分布を確保しました。翌日、プレートはまずCloneSelect Imagerでモニタリングされ、day0のウェルコンフルエンスデータを取得しました。その後、異なる化合物を三重複ウェルに添加しました。濃度は、5-フルオロウラシルでは256.2 μMから0.039 μM、シスプラチンおよびオキサリプラチンでは167 μMから8.47 nMまでの三倍希釈系列です。未処理細胞（コントロール）と処理細胞を含むマイクロプレートは、異なるタイムポイント（day1、day2）でCSIにより繰り返し測定され、細胞増殖をモニタリングした後、インキュベーターに戻しました。day3には、同一プレートで同一タイムポイントの細胞毒性データを取得するため、まずイメージャーでスキャンし、その後、アッセイキット#1または#2の「ワンソリューション」を各ウェルに30 μL添加し、プレートを37°Cで2時間保持しました。SpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダーを使用し、アッセイキット#1では490 nmで吸光度（光学濃度、OD）を測定し、アッセイキット#2では570 nm/605 nmの比率で測定しました。

統計解析

CloneSelect Imagerアッセイまたは比色アッセイで得られたすべてのデータは、細胞なしコントロールウェル（バックグラウンド）の値を細胞を含むウェルの値から差し引いてバックグラウンド補正しました。薬剤処理による細胞への影響は、以下の式を用いて計算しました：

$$ \text{細胞生存率（\%）} = 100 \times \frac{\text{サンプル}}{\text{コントロール}} $$

CSIアッセイで測定した薬剤効果を推定するため、ウェルコンフルエンスを解析し、非処理細胞（コントロール）をアッセイ終了時に100%生存細胞として相対細胞生存率を計算しました：

$$ \text{相対細胞生存率（\%）} = 100 \times \frac{\text{サンプル}}{\text{コントロール}} $$

EC₅₀値は、SoftMax® Pro 7.1ソフトウェア（モレキュラーデバイス）を用いて、非線形回帰4パラメータロジスティック曲線フィットにより決定しました。 EC₅₀は、最大細胞応答の50%を生じる薬剤濃度です。

結果

CSIアッセイと比色アッセイの結果は直接比較可能であり、同じウェルで異なる細胞密度を持つサンプルをCloneSelect Imagerでイメージングした直後に比色キットでアッセイしました。図2では、データは吸光度（アッセイキット）またはウェルコンフルエンス（CSIアッセイ）のバックグラウンド補正値をウェルあたりの細胞数に対してプロットしました。CSIアッセイと比色アッセイの両方で、96ウェルプレートにおいてウェルあたり10,000細胞から312細胞までの細胞密度を容易に測定できます。

図3では、薬剤（5-FU）を9種類の濃度でU937細胞と72時間インキュベートした際の用量反応曲線を示しています。CSIアッセイ（緑プロット）の用量反応曲線は、他の2種類の比色細胞毒性アッセイ（アッセイキット#1および#2）と一致しました。すべてのデータはSoftMax Proソフトウェアの4パラメータ用量反応曲線フィットを用いてプロットされました。ソフトウェアにより、類似したEC₅₀値が算出されました：2.2 μM（青プロット、アッセイキット#2）、3.0 μM（緑プロット、CSIアッセイ）、4.7 μM（赤プロット、アッセイキット#1）。

さらに、プラチナ系抗がん薬であるシスプラチンとオキサリプラチンも、5-フルオロウラシルと同様の方法で試験しました。図4では、CSIが直感的なヒートマップと円グラフを提供し、両プラチナ薬剤が72時間細胞とインキュベートされた後に示す異なる細胞毒性活性を明らかにしました。同濃度で処理したシスプラチンとオキサリプラチンでは、オキサリプラチンがU937細胞に対してシスプラチンよりも強い細胞毒性を示し、これは他の癌細胞株での報告⁴と一致しています。この結果は、CSIアッセイ直後に同じサンプルで実施した2種類の比色アッセイ（アッセイキット#1および#2）でも確認されました（表1）。オキサリプラチンはより低いEC₅₀値を示し、より高い細胞毒性を示唆しています。CSIアッセイで得られた3種類の抗がん薬のEC₅₀値は、従来の比色細胞毒性アッセイで得られた値と比較して1～2 μMの範囲内でした。

表1. 非接着性U937細胞を用いて3種類の抗がん薬化合物を72時間インキュベートした後に得られたEC₅₀（μM）値です。

結論

本研究では、CloneSelect Imagerアッセイと、広く使用されている2種類の吸光度ベース比色細胞毒性アッセイを比較し、U937細胞に対する3種類の抗がん薬化合物の細胞毒性効果を定量化しました。3種類すべてのアッセイで非常に類似したEC₅₀結果が得られました。しかし、CSIアッセイは、試薬コストゼロ、インキュベーション時間ゼロ、サンプルハンドリングの手作業ゼロで、ウェル全体の細胞イメージングとウェルコンフルエンス判定を用いて、薬剤効果を2分以内にラベルフリーで直接評価できます。さらに、CSIアッセイは、薬剤処理や進行中の機能アッセイに介入することなく、複数のタイムポイントで繰り返しデータを収集できます。このラベルフリーかつ非侵襲的な特性により、新規化合物スクリーニングや創薬初期段階での時間とコストを大幅に削減できます。これらの特徴により、CloneSelect Imagerは、薬剤スクリーニングや薬理学研究において従来の比色細胞毒性アッセイに代わる魅力的な選択肢となります。

参考文献

1. Mosmann T: Rapid Colorimetric Assay For Cellular Growth And Survival- Application To Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. J Immunol Methods 1983, 65(1-2):55-63.
2. Liu G, Chen S, Hu A, et al. The Establishment and Validation of the Human U937 Cell Line as a Cellular Model to Screen Immunomodulatory Agents Regulating Cytokine Release Induced by Influenza Virus Infection. Virol Sin. 2019 Dec;34(6):648–661.
3. Ghoshal, K., and Jacob, S. T., An alternative molecular mechanism of action of 5-fluorouracil, a potent anticancer drug. Biochem. Pharmacol., 53(11), 1569-1575 (1997).
4. Marqués-Gallego, P., den Dulk, H., Backendorf, C. et al. Accurate non-invasive image-based cytotoxicity assays for cultured cells. BMC Biotechnol 10, 43 (2010).

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