Application Note QPix 400による簡単ピッキング：複数の選択モダリティ、幅広い微生物群
- 最高30,000コロニー/日、98%以上の効率性
- 効率的な搬送-寒天レベルセンサーによるピッキングピンの高さ自動調整
- 最適化された生物特異的ピン
- ターゲット-定量的、ユーザー定義の選択基準
- 賢いコロニー選択ソフトウェア
PDF版（英語）
はじめに
次世代の抗生物質を発見するにしても、塩基配列決定のためにクローンを選別するにしても、あるいは微細藻類をバイオ燃料生産工場にするにしても、最高のコロニーを見つけるためには、何千、何百万ものコロニーをスクリーニングする必要があるだろう。何度も何度も。そして、単にスクリーニングするだけでなく、プレートを作り、複製する。
自動コロニーピッカーは、このような手間のかかるプロセスを簡素化し、スピードアップすることができる。しかし、選択するのではなく、スクリーニングする必要がある場合、制限培地上での増殖能力だけではなく、形態に基づいてコロニーを選択する必要がある場合はどうだろうか？大腸菌以外の微生物を扱う場合はどうでしょう？微生物コロニーピッカーQPix™ 400シリーズがあれば、細菌、真菌、藻類、ファージ、酵母細胞の形態学に基づくコロニーピッキング、プレーティング、プレート複製をすべて行うことができます。
QPix 400コロニーピッカーは、蛍光強度、青／白選択、サイズと近接性、阻止帯など、多様な微生物と複数の選択様式をサポートしています。
コロニー選択ワークフロー
QPixソフトウェアを開き、コロニーのサイズ、コンパクトさ、その他の形態学的特徴などのコロニー選択パラメータを定義します。Zone of Inhibition検出では、Zone of Inhibition検出モジュールでパラメータを設定します。コロニーは白色光で検出され、必要に応じて蛍光強度でさらに選択される。
白色光下でのコロニー選択
白色光で可視化されたコロニーの選択は、QPixコロニーピッカーを使用するほとんどの研究の典型的な最初のステップである。この例では、Streptomyces venezuelaeをプレーティングし、37℃で一晩培養し、白色光でコロニーを選択した。インテリジェントなソフトウェアモジュールが画像を解析し、ユーザーが定義した選択基準を満たすコロニーが黄色で輪郭を描かれ、選択される（図1）。選択基準を満たさないコロニーは赤でハイライトされる。
図1：S. venezuelae
メッキされたコロニー（左のパネル）。インテリジェントソフトウェアモジュールは、ユーザーが定義した基準に基づいて目的のコロニーを検出し（中央と右のパネル、黄色で塗りつぶされたコロニー）、選択基準を満たさないコロニーを拒絶する（中央と右のパネル、赤で塗りつぶされたコロニー）。
蛍光によるコロニー選択
蛍光ベースのセレクションを用いれば、価値の高いターゲッ トを早期に選択できるため、下流の処理時間を大幅に短縮できる（図 2）。適切な蛍光マーカーを使用することで、形態学的スクリーニングと機能的スクリーニングを自動化されたセレクションの段階で組み合わせることができ、下流の機能的アッセイでさらにスクリーニングや特性解析を行うコロニーの数が少なくて済むため、時間とリソースを節約できる。
図2：蛍光選択は、価値の高いターゲットに下流のアッセイとスクリーニングを集中させることで、スクリーニング時間を短縮する。
この実験では、親油性蛍光色素であるナイルレッドを用いて、バイオ燃料生産用のロドコッカス・オパカスPD630の高脂質生産株を選択した。脂質含量の高いコロニーは、それに応じて蛍光強度も高くなる。この実験では、コロニーの大きさ、直径、コンパクトさなどのパラメーターを最適なコロニー選択のために調整し、高脂質蓄積の結果として高蛍光を示すコロニーを選択（つまりゲート）するために、50,000を超える平均蛍光強度閾値を設定した（図3）。
図3：脂質の蓄積を反映する蛍光ベースの定量化により、QPix 400シリーズでの客観的なコロニー選択が可能になる。
脂質蓄積レベルはピッキング後にさらに確認した。液体培地で一晩増殖させた後、培養液を親油性の明緑色蛍光色素BODIPY 505/515（Life Technologies社製）で0.5μg/mLの濃度で染色し、蛍光測定をSpectraMax® M5 Multi-Mode Microplate Readerで記録した。QPix 420システムを用いて独自に選択・採取した高脂質蓄積性コロニーでは高度の蛍光が確認されたが、陰性対照の大腸菌コロニーではバックグラウンドレベルの蛍光が示された（図4、赤色曲線）。
図4：SpectraMax M5マルチモードマイクロプレートリーダーで、親油性蛍光色素BODIPY 505/515で染色した高脂質産生コロニーと陰性対照群の蛍光測定。高脂質産生コロニーは高い蛍光（RFU）値を示し、対照的に陰性コロニーは赤で描かれたように平坦なラインのシグナルを示した。
青／白のカラースクリーニングによるコロニー選択
青色または白色でコロニーを選択することで、組換え/非組換えクローンを選択するために広く使用されているLacZレポーターシステムを使用することができます。この例では、QPix 420システムで撮影した白色光画像を、使いやすいQPix™ソフトウェア2.0を使用して解析した。青色（図5A）または白色（図5B）のコロニーは、内蔵の Auto Select 機能（図5C）を使用して自動的に識別され、個別に選択されました。ヒストグラムのしきい値を調整し、コンパクトさ、軸比、直径、近接性などのコロニー選択基準を定義することで、選択をさらに最適化できます。
図5: (A) Auto Select Blueで選択された青いコロニーの例を青い矢印で示す。(B) Auto Select Whiteで選択した白色コロニーの例を白矢印で示す。(C) ソフトウエアの柔軟性により、強度のしきい値を手動で調整し、より強力な青色コロニーを選択するなど、結果を最適化できる。
阻害ゾーンを形成するコロニーの選択
抗生物質産生菌のスクリーニングと選択に対するライブラリーベースのアプローチでは、寒天平板をベースとしたゾーン・オブ・インヒビションまたはクリアリングゾーン検出アッセイが選択される方法である。抗菌活性を示すコロニーは、抗菌性化合物の分泌により細菌の増殖が阻害されるクリアリングゾーンを分泌することで、他の集団と区別される。クリアリングゾーンの直径は通常、産生される抗菌性化合物の量に比例する。したがって、価値の高い菌株とは、最大のクリアリングゾーンを生成する菌株である。
QPix Software 2.0以上のZone of Inihibition Detectionモジュールを使用すると、抗菌薬産生コロニーの大きさと、そのコロニーによって生成されるクリアリングゾーンの大きさの両方を確実に定量化することができます。最大のクリアリングゾーンを生成するコロニーを選択することができます（図6）。
図6：QPix Software 2.0以上のZone of Inhibition Detectionモジュールでは、各コロニーのサイズと対応するクリアリングゾーンを特定できる。クリアリングゾーンを生成するコロニーは、ユーザー定義の選択基準に基づいて選択される。
ライブラリベースのスクリーニングや適応進化研究における自動阻害帯検出の有用性を実証するため、微生物培養のライブラリをスポットしたQTrayをスクリーニングし、選択した。QTrays上で増殖した48のコロニーから、QPixソフトウェアのZone of Inhibition Detectionモジュール（図7）により、阻害ゾーンを形成する3つのコロニーが確実に検出され、選択され、摘出された。
図7：抗生物質探索のための、阻害ゾーン産生コロニーのライブラリーベースのハイスループットスクリーニング。QPix Software 2.0以上のZone of Inhibition Detectionモジュールにより、クリアリングゾーンを産生するコロニーを確実に検出・選択できる。対応するクリアリングゾーンを生成する選択されたコロニーは黄色でハイライトされている。
このアプローチは、大規模な微生物ライブラリーからクリアリングゾーンを生成するコロニーをスクリーニングし、同定し、採取することを目的としたハイスループットの実施に適している。
大腸菌以上のものを選ぶ
コロニー移動の失敗が繰り返されると、プロジェクトの遅延、生物材料の浪費、または貴重なクローンの損失につながります。多様な微生物に最適なコロニー移植を確実に行うため、モレキュラー・デバイスは様々な形状、サイズ、質感のピッキングピンを提供しています。各微生物固有のピンは、指定された微生物コロニーの形状、粘着性、粘性、またはピッキング効率に影響を与えるその他の特性に合わせて設計されています。
さらに、独自の寒天高さセンサーが最適なピッキング高さをその場で自動的に判断するため、生物学的材料の最適な移送と取り出しを可能にする。
適切なピンの選択と自動寒天高さセンシングを組み合わせることで、微生物コロニーの移植効率は、データセット例（図8）に示されるように、40％も向上する。
図8：コロニー移植効率は、微生物とコロニーピッキングピンの組み合わせによって大きく変化する。大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、S. venezuelaeの代表的なデータセットを示す。
大腸菌用に最適化されたコロニー検出アルゴリズムが、酵母や藻類など表現型の異なる微生物に適用された場合、最適に機能しない可能性があるため、QPixソフトウェアは、幅広い微生物種の選択をサポートするようにも設計されています。QPixソフトウエアは、さまざまな微生物から生産されたコロニーを自動的に同定・選択することで、実験の柔軟性を提供する（図9）。さらに、形状、サイズ、隣接する物体との近接性などのパラメーターをカスタム定義する機能により、コロニー形成微生物を効率的かつオーダーメイドで選択することができ、微生物固有のピンが効率的なコロニー移動を保証します。
図9：QPixのコロニー検出アルゴリズムにより、ユーザー定義のパラメータ（コンパクトさ、軸比、サイズ、近接度）に基づいて、形態学的に異なるコロニーが識別される。黄色の枠で囲まれたコロニーはユーザー基準に基づいてピッキングの対象として選択され、赤色の枠で囲まれたコロニーはユーザー定義の基準を満たさないためピッキングから除外される。
概要
洗練されたアルゴリズム、カスタマイズ可能な選択基準を備えた使いやすいソフトウェア、生物に特化したアルゴリズムとアクセサリーを備えたQPix 400シリーズのコロニーピッカーは、自動化がライフサイエンスのニーズと相乗効果を発揮するユニークなソリューションです。コロニーピッキングの精度とスピード、さまざまな生物に最適化されたハードウェアソリューション、堅牢なソフトウェアアルゴリズムは、あらゆる数のスクリーニングプロジェクトに対応する柔軟性とパワーを提供します。QPix 400があれば、適切なコロニーを簡単に選択できます。
Molecular Devices QPix チームは、引き続き新しいアプリケーションノートをライブラリに追加しています www.moleculardevices.com/qpix-resources
PDF版（英語）