Application Note FLIPRカルシウム6アッセイキットで
カルシウムスクリーニングを強化

はじめに

Molecular Devices社のFLIPR® カルシウムアッセイキットは、高感度カルシウムインジケータと特許取得済みマスキング色素を使用しており、Gタンパク質共役型受容体（GPCRs）、イオンチャネル、およびその他のカルシウム感受性ターゲットの高感度蛍光スクリーニングを行うことができます。カルシウム流動アッセイウィンドウのシグナルをさらに向上させる新規色素製剤を使用することで、アッセイプロトコルの柔軟性を高めると同時に、アッセイのロスト性を向上させている。図1に示すように、FLIPR Calcium 6アッセイマスキング技術はセル内には入らず、細胞外に残存するカルシウム指示薬や培地、その他の成分に由来するバックグラウンド蛍光を大幅に低減します。FLIPR Calcium 6-QFアッセイキット（図1）にはマスキング技術が含まれておらず、クエンチ感受性の高いターゲットやマルチプレックスアプリケーションにフレキシブルなオプションを提供します。アッセイにプロベネシドを使用する必要がほとんどないため、アッセイの柔軟性がさらに高まります。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株のような特定のセルには陰イオン交換タンパク質があり、一般的に使用されるカルシウムインジケータを細胞質内に保持するためには、プロベネシドのような陰イオン再取り込み阻害剤を使用する必要があります。しかし、FLIPRカルシウム6測定キット独自の色素製剤は、このような有機アニオントランスポーターに対してより耐性があるため、プロベネシドの必要量が少ないか、あるいは全く必要ない可能性があります。

FLIPRカルシウム6およびカルシウム6-QFアッセイの調製

本試験ではFLIPR Calcium 6（製品番号R8190）およびCalcium 6-QF（製品番号R8192）Explorerキットを使用した。両染料は、20mM HEPESを含むHank's Balanced Salt Solution（HBSS）で調製した。プロベネシド（PBX）は、セルからの色素の流出を抑制するために必要に応じて添加した。前夜にプレーティングした接着細胞CHO M1細胞（384ウェルブラックセルプレートおよびクリアセルプレート）をインキュベーターから取り出し、25 µLのFLIPR Calcium 6、Calcium 6-QF、Calcium 5 Assay Kit色素、または競合キットの色素ローディングバッファーを、25 µLのアッセイバッファーまたは培地を封入したウェルに添加した。

FLIPR Calcium 6およびCalcium 6-QFキットの場合、色素を添加したプレートを37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。FLIPR Calcium 5 Assay Kitおよび競合キットは、推奨プロトコールに従い、アッセイ前に37℃、5% CO2で1時間インキュベートした。すべてのプレートをインキュベーターから取り出し、FLIPR® Tetra システムまたはFlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダーで読み取る10分前に室温まで冷却しました。

FLIPRカルシウムアッセイキットまたはFluo-4 Directキットのいずれを用いたプレートでも、色素負荷後の洗浄は必要ありませんでした。Fluo-4色素のみのプレートはHBSSアッセイバッファーで3回洗浄した。

FLIPR TetraシステムとFlexStation 3リーダーを用いたカルシウム動員アッセイ

HBSS緩衝液＋20mM HEPESで5倍濃度の適切なリガンドを384ウェルポリプロピレンプレートに調製した。アゴニストはFLIPR TetraシステムまたはFlexStation 3リーダーで最適化されたパラメーターで検出中に添加した。相対蛍光単位（RFU）で測定したシグナルは、添加中と添加後を含めて各ウェルで約90秒間検出した。算出された出力は、シグナルウィンドウ（∆f/f）最大値から最小値を引いたものである。グラフおよびEC50/ IC50濃度のデータは、ScreenWorks® または SoftMax® Proソフトウェアからエクスポートし、GraphPad Prismを用いて計算した。Z因子の計算は、Zhang, et. al.に記載された方法で行った。

結果

FLIPRカルシウム6アッセイキットと他のカルシウム指標との比較は、ATCCのCHO M1WT3細胞のムスカリン受容体のアゴニズムを用いて測定した（図2）。各アッセイは、製造元の指示に従い、色素負荷に最適な時間でインキュベートした。Fluo-4ウォッシュ（Fluo-4W）アッセイは、細胞操作と細胞外蛍光バックグラウンドが大きいため、ウィンドウが最も小さかった。FLIPR Calcium 6およびCalcium 6-QFキットは、それぞれ∆f/f = 4および4.2という最も高いシグナルウィンドウを示した。EC50値はすべてのケースで維持され、FLIPR Calcium 6 KitはアゴニストアッセイでZ @ EC80= 0.88を示した。

アロステリックモジュレーターのスクリーニングには、EC30量のリガンドを使用する必要がある。この低濃度のリガンドで大きなシグナルウィンドウを持つことが不可欠である。CHO M1WT3細胞をEC30濃度のカルバコールで刺激した（図3）。FLIPR Calcium 6 Assay Kitのシグナル強度は競合キットの2倍であった。

FLIPR Calcium 6 アッセイキットは幅広い細胞株で使用できます。図4では、内因性ヒスタミン1レセプター（ECACC, Porton Down, Salisbury, UK）を発現する "アッセイ準備のできた "1321N1凍結細胞をFLEXstation 3リーダーでアッセイした。FLIPRカルシウム5アッセイキット、Fluo-4 Directキット、FLIPRカルシウム6アッセイキット、FLIPRカルシウム6-QFアッセイキットを用いて、ヒスタミン濃度の増加に対するヒスタミン受容体の反応を比較した結果、FLIPRカルシウム6アッセイキットが最も高いシグナルウィンドウを示した。SoftMax Proソフトウェアが算出したEC50値は、予想値のHalf-log以内でした。

CHO M1細胞は、Fluo-3やFluo-4などの一般に使用され るカルシウムインジケーターを保持するために陰イオン再取り込 み阻害剤プロベネシドの使用が必要です。FLIPR Calcium 5 Assay Kitの色素も細胞から排出されるため、プロベネシドがないと反応が見られない。FLIPR Calcium 6 Assay Kit の蛍光色素は細胞内に保持されやすいように設計されています。図5は、プロベネシド無添加のFLIPRカルシウム 6アッセイキットではシグナルが小さくなることを示すが、それでもシグナルウィンドウは2倍を超え、EC80= 0.86のZファクターが得られた。EC50値はHalf-log以内であった。

結論

FLIPR Calcium 6およびCalcium 6-QFアッセイキットは、フレキシブルなカルシウム流動アッセイオプションを提供すると同時に、信頼性の高い薬理学、優れたシグナルウィンドウ、スクリーニングに必要な高品質のアッセイ性能を提供します。今日の多くのアッセイでは、過剰発現レセプターを用いた標準的なアゴニズム／アンタゴニズムアッセイでは見られない課題が存在するため、シグナルウィンドウを大きくすることは重要である。内因性レセプターを持つセルライン、低発現レセプター、凍結細胞、初代細胞、幹細胞を使用すると、全体的な反応が低くなる可能性があります。FLIPR カルシウム 6 キットが提供する大きなシグナルウィンドウは、これらの困難なターゲットや細胞株を用いた化合物のスクリーニングや最適化のためのロバスト性アッセイを提供します。さらに、シグナルウィンドウが大きいことは、アロステリックモジュレーターを同定するためのアッセイを行う際にも有利です。クエンチなしのFLIPRカルシウム6-QFアッセイキットオプションは、マルチプレックスアッセイやクエンチ感受性の高いターゲットの研究を可能にする新しいアッセイのフレキシブルなオプションを提供します。最後に、アニオン再取り込み阻害剤非存在下でCHO細胞のような細胞株で標的の挙動を研究できることは、プロベネシドに感受性のある受容体もあり、その使用が自然生物学的メカニズムを変化させる可能性があるため、有益である。

以下のMolecular Devices®システムと互換性があります。

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