Application Note 蛍光偏光アッセイの確立と最適化

目的

このテクニカルノートは、既存のアッセイをロバスト性蛍光偏光フォーマットに変換するための最適な実験条件を定義するための情報を提供することを目的としています。例として、レセプターとリガンドの結合を評価するためによく使用されるタイプの競合結合アッセイを取り上げます。蛍光偏光の基本原理に精通していることを前提としています。

FP受容体-リガンド結合アッセイをデザインする際の留意点

1. トレーサーとバインダーのサイズ差を最大にする。フルオレセイン、Texas Red、Cy 5、BODIPYなどの通常の蛍光色素を使用する場合、トレーサーは10kD以下のペプチドと同程度のサイズでなければならない。より大きな結合剤は50kD以上であるべきである。分子量の10倍の差が有用なターゲットである。しかしながら、これらの基準を満たさなくても、結合ペアの評価を妨げるべきでない。FPに関する最初の研究では、アルブミン(60kD)と抗体(160kD)を用いて発表可能な結果を得た。
2. 非特異性蛍光偏光に対する他のアッセイ材料の寄与を最小限にする。トレーサーの純度、バインダーの純度、バッファー固有の蛍光、キャリアータンパク質のようなバッファー成分がトレーサーと結合する能力などが品質要因として挙げられる。ポリスチレンのような一部のマイクロプレート材料は、遊離トレーサーを結合することができ、それによって全偏光を増加させる。いくつかのベンダーから販売されている非結合性マイクロプレートがこの問題の解決策となります。
   1. トレーサーは90％以上標識されていなければならない。トレーサーを高い割合で標識しないと、非標識トレーサーがレセプターと競合し、見かけのIC50（相互作用の見かけの親和性、したがってIC50の計算値に影響する）が変化する。同様に、トレーサーから遊離蛍光体を精製できない場合、全 蛍光の偏光部分が増加し、偏光を変化させることができなくなる。
   2. 精製度の高いバインダーを使用する。大きなタンパク質、細胞膜、細胞残屑は光を散乱させ、全偏光の正味の増加を引き起こすため、不純物は最小限に抑えるべきである。これらの不純物は、適切なSB比減算によって部分的に補正することができますが、精製したレセプターを使用することにより、シグナル（ひいてはSN比）への寄与を最小限に抑えることが望ましいです。レセプター調製物の凍結を繰り返すと凝集が進み、アッセイ性能が低下する可能性があります。凝集体を除去する方法としては、細いシリンジを通 して破砕する方法や、沈殿／遠心分離して大きな物質を除去する方法があります。
   3. シグナルに対するバッファーの寄与を最小限にする**。バッファーの蛍光バックグラウンドの増加は、目的の波長で蛍光を発する汚染物質によるものである。原材料、混合容器や保存容器の清潔さ、バッファー調製法などに注意することで、これを許容レベルまで減らすことができるはずです。バッファーや非フルオロフォア成分による高いバックグラウンドカウントは、アッセイのシグナル対ノイズ比や最終的な感度に深刻な影響を与える可能性があります。
   4. ウシ血清アルブミン**は避けてください。タンパク質用緩衝液には、ウシアルブミン（BSA）のような担体タンパク 質が含まれていることがよくあります。アルブミンは一部の蛍光色素と結合する可能性があり、ベースラインの偏光をスプリアスに増加させ、アッセイ範囲を狭める可能性があります。解決策としては、キャリアタンパク質を避けるか、ウシガンマグロブリン（BGG）のような結合性の低い代替タンパク質を使用する方法があります。いずれにせよ、タンパク質を添加したバッファーと添加していないバッファー中のトレーサーの偏光を比較することで、トレーサーの正味の偏光に対するバッファータンパク質の寄与を評価することは有用です。あるいは、BSAの最終濃度を下げて、これらの影響を最小にする。
3. フォーマットの目標を定める。マイクロプレートの種類、アッセイ量、アッセイ速度とアッセイ感度／精度の相対的重要性を定義する。最終的なキャンペーン条件に近い条件下でフィージビリティスタディを実施するのが最善です。アッセイ実現可能性は、目標量より多いアッセイ量から開始することもできる。
4. 開発基準の定義。アッセイ開発及びアッセイバリデーションには、通常、HTSキャンペーン中に実施される単一 ウェルよりも多くの反復及びコントロールが必要となる。評価基準には、試薬消費量、読み取り時間、インキュベーション時間と条件、SN比（下記参照）、精度、感度、再現性などが含まれる。

FP受容体-リガンド結合アッセイの確立と最適化のためのステップ

1. インストゥルメンテーションに最適な設定を見積もります。以下は、インストゥルメンテーション設定の出発点として推奨されるものです。PMTの設定、Zの高さ、ウェルあたりの積分時間またはフラッシュ数から始めます。
2. 遊離トレーサーの最適濃度を決定する。このステップでは、発生するシグナルと偏光の濃度独立性を調べることにより、トレーサーの許容濃度範囲を決定する。良好なシグナル対ノイズ比が得られるトレーサーの最低濃度を選択する。もちろん生化学的な考慮も必要である。トレーサーの濃度は、Kd（既知の場合）より低く、バインダー（すなわちレセプター）の濃度より低くなければならない。遊離トレーサーと遊離フルオロフォアの比較（遊離フルオロフォアをパラレルに走らせる）により、トレーサーサイズの適合性を確立する。トレーサーのmPが遊離フルオロフォアのmPより有意に大きい場合、トレーサーはFPに使用するには大きすぎる可能性がある。
   1. 遊離トレーサーを4つ以上のレプリケートで連続希釈する（例えば、100 nMから0.1 nMまで）。

   2. トレーサーの研究と並行して、遊離蛍光体を評価する。遊離蛍光体（例えば、トレーサーの標識に使用したものと同 じもの）を、4つ以上のグループ（例えば、100 nM から 0.1 nM）で連続希釈する。

      各シリーズは、その後のバックグラウンド「ノイズ」レベルの統計的評価を可能にするため、少なくとも4点のレプリケートで確立する。

   3. 各 S 及び P 値から差し引くために、[Buffer only]コントロールを含める。バックグラウンドの減算には、SとPの平均値 [Buffer only]を計算し、トレーサーまたは遊離フルオロフォアを封じ込め たウェルの個々のSとP値から平均値を減算する。
   4. 想定される理論的なmP（フルオレセインとテキサスレッドの場合は27）と、SとPの両方でバックグラウンドより十分高いカウントが得られる濃度の遊離蛍光体の結果を用いて、G因子を計算する。 G = P/S *[(1-27/1000)/(1+27/1000)]。SとPは、遊離フルオロフォアの値からバッファーのみのコントロールを差し引いた値である（「バックグラウンド差し引き」）。

   5. 遊離トレーサーのmP値を計算する： mP =[(S - P*G)/(S + P*G)]*1000. ステップ2dで計算したG因子を使用する。SとPは、バックグラウンド減算した遊離トレーサーの値である。コントロールとして、遊離蛍光体は理論値に近いmP値を持つべきである。理想的には、トレーサーは遊離のフルオロフォア単独の値に近い値を持つべきで、これはリガンドのサイズと回転速度がフルオロフォアとの共役によって大きく影響されたことを意味する。値がはるかに大きい場合は、トレーサーが十分に大きく、バインダーと複合化したときに有効な偏光変化を減少させる可能性があることを示唆している。トレーサーの許容濃度範囲には、規定の27mPに近い偏光値（mP単位）を与えるすべての濃度が含まれる。さらに、トレーサーは、活性の低いチャネルのバックグラウンド（通常はPカウント）をはるかに上回るカウントを与える濃度に限定する。生のシグナル値を調べる：トレーサーはバッファーのみのシグナルの少なくとも3倍でなければならない。

      蛍光強度モードでプレーティングを再読することにより、遊離トレーサーの消光の程度を評価することができる。消光効果は蛍光ベースのアッセイの最終感度に影響を与える可能性があります。蛍光標識分子と遊離溶液中の蛍光標識分 子自体のモル蛍光強度を比較して、化学的カップリングプロセ ス自体による消光の程度を判断する。例えば、消光がなければ、1 nMのフルオレセイン化ペプチドのシグナルは、1 nMのフルオレセインナトリウムのシグナルと同じになるはずである。他の分子に結合したフルオレセインが遊離のフルオレセインよりも蛍光を発するとは考えにくいので、トレーサーの濃度割り当てが正しくない可能性がある。同様に、同じ濃度の遊離標識のシグナルの20％以下のトレーサーは、非常にクエンチされているか、標識されたトレーサーの割合が低すぎるか、値の割り当てが正しくないか、または上記のいくつかの組み合わせである可能性がある。

      蛍光偏光によって蛍光強度の約10-90％が失われることが多い。このこと自体が、蛍光強度測定とは対照的に、蛍光偏光の感度を低下させる可能性がある。

3. バインダーを適切なコントロールで滴定する。このステップの目的は、バインダーとトレーサーの最適濃度を決定することである。適切なコントロールを用いることで、特異性偏光を正確に推定することができる。複数の濃度のバインダー（「Protein」）を、トレーサーあり、トレーサーなしで試験する。バインダーは正味のシグナルに寄与する可能性があるため、トレーサー無しのバインダーが適切なコントロールとなる。バインダーはトレーサーより高濃度にする。最初は複数の濃度のトレーサーを使用することを検討する。トレーサーはKd以下であるべきである。最初の試験では、トレーサーとバインダーの両方にかなり広い濃度範囲を含めることができるが、フォローアップ試験では、トレーサーの1濃度のみを使用し、バインダーの限界希釈法シリーズを狭い間隔で使用することができる。良い出発点は、バインダーを4X Kdから滴定し、トレーサーを1X Kdから滴定することである。初期の研究では、少なくとも3回の反復を行う。反復数を増やすことで、アッセイの不正確さをより正確に推定できる。アッセイの不正確さを正確に確立するために、各実験条件は少なくともトリプリケートで実施する。特異性対照群は以下の通り：
   1.  [緩衝液のみ]：特に緩衝液中に妨害分子（例えばスクロース）が存在する場合、S及びPシグナルに対する緩衝液のみの寄与を示す。これは[Tracer only]のバックグラウンドサブトラクションとして使用される。

   2. [トレーサーのみ]： S と P のバックグラウンド減算値は、G = S/P *[(1-27/1000)/(1+27/1000)] である G factor の計算に使用されます。

      SとPは、遊離トレーサーを[Buffer only]コントロールで減算した値です。Gは非常に安定した値であり、前のステップで計算した値が適切であるはずですが、この時点でGの先の推定値を確認することは価値があります。

      シグナル／ノイズの代表的な値は、トレーサーのみの S 値から計算できることに注意してください。理想的には、シグナル[トレーサーのみ]対ノイズ[バッファーのみ]の値が少なくとも10倍を目標にする。

   3.  [Protein only]：特異性タンパク質バインダーによる光散乱の寄与を示し、特にそれが膜結合型である場合に価値がある。これは[Protein + Tracer]のバックグラウンドサブトラクションとして使用されます。複数の濃度のタンパク質を使用するため、それぞれをトレーサー非存在下でテストし、平均SおよびP値を計算し、個々のウェルのSおよびP値から差し引いてmPを求める必要があります。

   4.  [タンパク質＋トレーサー］：最大mPを決定する。これらには、タンパク質とトレーサーの最適濃度を同定するために、トレーサーの滴定に対してタンパク質を滴定する、このチェッカーボード研究の主要グループが含まれる。上述したように、良い出発点は、タンパク質の4X Kdとトレーサーの1X Kdから滴定することである。

      もし[binder]=Kdで、[tracer]<[binder]であれば、トレーサーの半分が結合しているはずです。SとPは[Protein + Tracer]を[Protein only]のコントロールで減算した値です。バックグラウンドサブトラクションには、SとPの平均値[タンパク質のみ]を計算し、トレーサー、タンパク質、化合物/コントロールを封じ込めたウェルの個々のSとPの値から適切な平均値を差し引く。ステップ2bで計算したG factorを使用する。

   5. 評価するパラメータは3つあります：バックグラウンドで減算したmP値、アッセイの不正確さ、偏光の変化です。不正確さとは、mP値の各グループの平均値の標準偏差です。これは一般的に10mP未満であるべきである。偏光の変化としてのアッセイ範囲は、[Protein + Tracer]の平均mPから遊離トレーサーの平均mPを引くことによって計算されます。プラトー効果があるはずで、バインダーの最適濃度を超えるとmPはそれ以上増加しない。10mP未満の不正確さとmPの最大の変化を与えるバインダー濃度は、最大のアッセイ範囲を提供する。しかし、バインダーの濃度がわずかにサブプラトーであれば、より優れた性能が得られ、貴重な試薬の消費量も少なくなる。偏光の正味の変化は70mP以上であることが理想的です。

      SN比は、正味の変化を標準偏差で割ることによって計算することができる。従って、偏光の純変化を大きくしたり、標準偏差を小さくすることで、アッセイ性能が向上します。

4. 1つまたは複数のアッセイ製剤で競合物質を力価測定する。コンペティターは、非標識トレーサー、またはトレーサーとバインダーの結合を阻害することが知られ ている他の分子であってもよい。トレーサーとバインダーは、ステップ 3 で決定した濃度で使用し、mP を大幅に増加させる。阻害曲線はシグモイドになるはずである。競合物質の2倍、3倍、または5倍希釈系列を使用し、最も分かりやすい結果を得るために希釈の数対数をカバーする。偏光の正味50％減少を与える中点をIC50とする（ICは阻害濃度を意味する）。この値は、科学文献に発表されている値や、あなたの研究室の他の方法で得られた値と比較することができる。この場合も、不正確さと偏光の正味の変化を評価する。
5. アッセイ特性評価。この時点で、アッセイにおける試薬添加ステップの数や、トレーサーと結合剤を単一の試薬として組み合わせる可能性を検討することが有用であろう。キャリブレーター、陽性及び陰性コントロールのような競合試薬は、化合物が提供される容量及びバッファーで添加されるべきである。例えば、化合物が 10%DMSOを含むバッファーで提供される場合、競合試薬もこの形態であるべきである。溶媒（DMSO）、インキュベーション時間と温度、試薬の保存安定性に対するシステムの感度を評価するために、追加の制御群を含める。その他の性能基準もこの段階で評価することができる。

6. トラブルシューティング。不正確さまたは正味偏光変化が許容できない場合は、不正確さの原因を評価するための手 段を講じる。インプレシジョンの原因と思われるもの（ピペッティング、インストゥルメンテーション、バッファ ー、トレーサー、タンパク質）を評価する。インプリシジョンの主要な（最大の）原因は、アッセイ性能を改善するための最も有益な領域であるべきです。正味の偏光変化が不十分な場合は、他のトレーサーや結合剤があれば評価する。200～300mP（またはそれ以上）の最大偏光値が達成されることはまれである。理論的に得られる最大偏光値を低下させる要因はいくつかある。分子自身によるフルオロフォアの消光、バッファー消光、表面への吸着、回転スピン（「プロペラ効果」）、成分間の相互作用の親和性の低さなどがこれに影響する。

   理論的に得られるmPの最大値は500mPである。従って、これ以上の実験値は、アッセイ内のアーチファクトを示唆する。このような場合、コントロールをチェックする必要がある。時折、成分によってはバックグラウンド強度が大きくなり、適切にコントロールされないと偏光効果を覆い隠してしまうことがある。

   システムの追加チェックとして、蛍光強度モードでプレートを再読取することをお勧めします。各ウェルに同量のトレーサーが存在する場合、蛍光強度モードではプレート全体で同じ強度値になるはずです。しかし、サンプルの条件（タンパク質との結合など）による消光効果や増強効果、試薬の添加ステップの不正確さなどがある場合は、強度測定のばらつきによって特定できる可能性があります。

一般的な考慮事項

• 外来偏光のコントロール：目的の生化学的結合現象に起因しない偏光をコントロールするために、2つの方法を用いることができる。外来偏光の原因の一つは、インストゥルメンテーションの光路にある光学面であり、これはGファクターによって補正される。無関係な偏光の第二の原因は、バッファによって寄与される偏光であり、これはバックグラウンドサブトラクションによって制御される。
• 最小mP：偏光値（mP）は蛍光分子の分子タンブリング速度の指標である。一定の温度と粘度の下で、分子サイズと分子形状に関係する。例えば、3 kDの分子は30 mPの偏光値を示すが、5 kDの分子は60 mPの値を示す。硬い球状のフルオレセイントレーサーでは、mPは約10kDで最大になる。最大値は500mPである。
• 最大mP：小さな遊離トレーサーが大きな分子に結合すると、mPは増加すると予想される。優れたFPアッセイでは、mPの変化は通常100以上である。
• データの評価：アッセイの性能は多くの方法で評価され、表現される。FPベースのレセプター結合アッセイの性能を説明する上で、2つのパラメータが特に有用である。一つ目はレセプターの添加による偏光の純増加です。これは、[トレーサー＋レセプター]グループのmPから遊離トレーサーのmPを引くことで計算できます。これが上の段落で述べたmPの変化です。第二のパラメータは、測定の不正確さである。これはシグナルの標準偏差で、単位はmPである。これらのFPアッセイではすべての実験グループが同量の蛍光を封じ込め ているため、シグナルとその標準偏差は化合物、タンパク質、コントロールの量や影響に依存しないと予想される。これら2つのパラメータを組み合わせる有用な方法はSN比の値に似ており、正味（または'Delta'）mPがシグナルに相当し、不正確さ（標準偏差）が'ノイズ'に相当する。テキスト
• 試薬： FPに必要な試薬が不足している場合、結合アッセイ用の市販キットが多数ある。