Application Note ScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダーによる
タンパク質分子量の推定

はじめに

ScanLater™ウェスタンブロットタンパク質ラダーはScanLater™ウェスタンブロット検出システムに不可欠なコンポーネントです。このプロテインラダーの主な用途は、タンパク質分子量の推定、ゲル電気泳動の可視化、ゲルからブロットへの転写プロセスの評価などです。ScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダーは7種類のビオチン化リコンビナントタンパク質と3種類の染色前マーカータンパク質で構成されています。ビオチン化タンパク質の検出は、二次抗体の段階でユーロピウム標識ストレプトアビジンをブロットに添加することで可能になります。ブロットはScanLater™ ウェスタンブロット検出カートリッジを使用して、SpectraMax® i3またはSpectraMax® Paradigm®マルチモードマイクロプレートリーダーで読み取ります。

ScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダー

ScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダーは、10, 20, 40, 50, 80, 100, 140 kDの7種類のビオチン化リコンビナントタンパク質で構成されています。これらはユーロピウム標識ストレプトアビジンとインキュベートすることで検出され、ScanLaterウェスタンブロット検出カートリッジで読み取ると淡色のバンドとして表示されます（図1、左）。さらに、18、31、70 kDの3つのマーカータンパク質があらかじめ染色されていることが確認できる（図1、右）。これらの青いバンドは電気泳動ゲルと転写後のブロットに見られます。また、ScanLater™ウェスタンブロット検出システムでラダーを読み取ると、濃いバンドとして見える。

ビオチン化ラダー蛋白質の分子量とゲル上での遊走距離の直線関係を、参照標準と比較して図2に示す。

ScanLater ウェスタンブロット検出法

ScanLaterウェスタンブロットのワークフローは、二次抗体インキュベーションステップまでの標準的なゲルローディングおよびウェスタンブロッティング方法に従います。目的のタンパク質サンプルと一緒に、ゲル上の1つのレーンに4µLのScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダーをローディングするだけです。ラダーを加熱したり、その他の準備をする必要はありません。一次抗体とのインキュベーション後、膜はブロッキングと洗浄を行い、その後1:5000 Eustreptavidinと1:5000 Eu-二次抗体とインキュベートします。Eu-ストレプトアビジンはタンパク質ラダーに結合し、Eu-二次抗体は目的のタンパク質に結合した一次抗体に特異的に結合します。

メンブレンは、SpectraMax ParadigmまたはSpectraMax i3マルチモードマイクロプレートリーダーと、ユーロピウム（Eu）の時間分解蛍光（TRF）検出を利用するScanLaterウェスタンブロット検出カートリッジを使用してスキャンします。TRF検出は、自動蛍光や他の短寿命発光源からのバックグラウンドノイズを大幅に低減します。化学発光や標準的な蛍光検出でよく見られるカメラのブルーミングがないため、高いS/N比でシャープなバンドが得られます。この方法は酵素反応を伴わないため、タンパク質の定量に特有のばらつきがない。ユーロピウムは光に溶けにくいため、ウェスタンブロットのシグナルは数週間から数ヶ月間安定し、メンブレンの繰り返し読み取りが可能です。ScanLaterウェスタンブロット検出システムは、ScanLaterウェスタンブロットプロテインラダーを含め、シンプルで高感度、安定したプラットフォームであり、マルチモードマイクロプレートリーダーで優れたタンパク質分析能力を提供します。

既知タンパク質の視覚的推定

Interleukin-17とHeat Shock Proteinを用いた更なる実験は、分子量の推定にScanLaterウェスタンブロットパク質ラダーを使用した例を示しています。

インターロイキン-17

Interleukin-17（IL-17）を1Xランニングバッファー中の4-20％グラジエントゲルにロードし、30分間反応させた。ScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダーも同じゲルにロードした。タンパク質をImmobilon-FL膜に移し、ラット抗IL-17抗体で一晩プローブした後、1:5000 ScanLater Eu-抗ラットIgG抗体および1:5000 ScanLater Eu-抗ストレプトアビジン抗体で1時間インキュベートした。図3aに示すように、ブロットを洗浄、乾燥し、ScanLaterウエスタンブロット検出カートリッジ付きSpectraMax i3マルチモードマイクロプレートリーダーを用いてスキャンした。ScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダーを用いたIL-17の分子量は約14kDと推定され、公表されている分子量範囲は約15kDであった。

ヒートショックプロテイン

ヒートショックプロテイン（HSP70）は、通常よりも高い培養温度にさらされたセルで誘導される。この研究では、細胞を45℃、45-90分間暴露した6時間後に、CHO-K1細胞とHeLa細胞から細胞抽出液を採取した。各細胞サンプルからの抽出液5µLを4-20%ゲル勾配で分析した。4µLのScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダーもゲルにロードした。転写後、ブロットをブロック、洗浄し、マウス抗HSP70で一晩プローブした後、Eu-抗マウスIgGで1時間インキュベートした。この実験では、ラダーは抗Eu-ストレプトアビジンと別々にインキュベートした。図3bに見られる逆像では、染色前の標準物質は、染色がTRFシグナルを消光するため、淡いバンドとして見える。どちらの細胞株も、温度が上がるとHSP70が増加する。ScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダーとの比較による推定では、タンパク質HSP70のサイズは約70kDである。

結論

ScanLaterウェスタンブロットタンパク質ラダーは、電気泳動中のゲル上、および転写中と転写後のブロット上に可視インジケータを提供しながら、図1のライトバンドとして見られるタンパク質のサイズを推定することができます。このシステムにより、ユーザーはアプリケーションに最適化された電気泳動とブロッティングのワークフローに従うことができる。Eu-ストレプトアビジンとEu-二次抗体のカクテルをインキュベートすることにより、SpectraMax i3またはParadigmマルチモードマイクロプレートリーダーのTRFモードで、ラダーと目的のタンパク質の両方を低バックグラウンドで検出できます。画像はSoftMax® Proソフトウェアで生成され、定量解析のためのカスタムExcelマクロへのエクスポートが統合されています。ScanLaterウェスタンブロット検出システムは、ScanLaterウェスタンブロットパク質ラダーを追加することにより、マルチモードマイクロプレートリーダーで優れた感度とタンパク質分析能力を提供します。

* ScanLaterウェスタンブロット試薬とシステムの全リストは弊社ウェブサイトをご覧ください。

以下のMolecular Devicesシステムと互換性があります

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