Application Note ヒトiPSC由来神経細胞培養液を用いた3Dマトリックスにおける
神経細胞発生の形態学的特性評価のためのハイコンテントアッセイ

はじめに

化合物スクリーニングのための、より複雑で、生物学的に適切で、予測可能な細胞ベースアッセイの開発は、創薬における主要な課題である。トランスレーショナルバイオロジーを推進するために、3次元（3D）アッセイモデルの開発と統合が普及しつつある。具体的には、3D培養は、構造、細胞組織、細胞-細胞間および細胞-マトリックス間の相互作用、より生理学的に関連した特性の拡散など、ヒト組織の側面を忠実に再現するという利点を提供する。

ハイドロゲルは、3D環境で神経細胞を増殖させるために、細胞外マトリックスをシミュレートするために広く用いられている。ハイドロゲルはポリ（エチレングリコール）（PEG）ベースで、完全に合成され、透明である。このハイドロゲルは、MMP切断可能な部位を封じ込め、細胞接着をサポートするRGDモチーフを含むことにより、細胞の遊走を許容するようになっている1。この完全合成ハイドロゲルは、ハイドロゲル表面に沈着した細胞の3次元的浸潤を促進する綿密な表面密度勾配を特徴とする96ウェルプレートにあらかじめキャストして開発された（3DProSeedTMハイドロゲル、Ectica Technologies）。このハイドロゲル・プラットフォームは使用が簡単で、オートメーションに適合する2,3（図1）。

ヒトiPS細胞由来の神経細胞は、ヒト由来であること、培養における生存率が長いこと、無制限に入手可能であることから、神経科学の応用において、初代細胞や動物モデルよりも有利である。

マルチウェルマイクロタイタープレートにおける3D神経突起ネットワークの形成

我々は、96ウェルフォーマットでの細胞培養と染色を最適化し、3Dマトリックスで増殖したニューロンの形態学的表現型と生存率を評価するための共焦点イメージングと解析プロトコルを開発した。

アッセイに使用したセルは、ニューロン（グルタミン酸作動性、ドーパミン作動性、GABA作動性）とアストロサイトからなるヒトiPSC由来細胞ミックスであるCNS.4UTM（Axiogenesis AG）である。CNS.4UTM細胞は、3DProSeedTMハイドロゲル（Ectica Technologies）中で最長14日間培養した。セルは200μLの培地に40,000ニューロン/ウェルでプレーティングした。一部の研究では、細胞播種密度の影響も評価した（5,000-80,000細胞/ウェル）。培地組成は、ニューロベース培地＋DMEM/F12＋サプリメント（Axiogenesis）を50：50で混合したものであった。

細胞をハイドロゲル表面に播種し、ハイドロゲル内部に浸透させた（図1）。神経突起伸長はプレーティングの24時間後から形成され始め、14日間培養した。神経突起ネットワークの形成は、透過光イメージングを用いて経時的にモニターした。終点測定では、セルを4％ホルムアルデヒドで固定した後、0.1％のTriton X-100で透過処理し、TuJ-1神経細胞マーカーに対する蛍光標識抗体とHoechst核染色を用いて染色した。

画像のスタックから3D画像を生成

ハイコンテントイメージングと解析を用いて、神経細胞ネットワークの形成に対する治療効果を評価した。焦点軸に沿った異なる平面で一連の画像を取得した（Z-スタック）（図2）。画像はImageXpress® マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムを用い、10Xまたは4X対物レンズで取得した。5～10μm間隔で11～33面のZスタックを取得し、深さ150～300μmをカバーした。2D プロジェクション画像（Maximum Projection または Best Focus）の自動保存に加え、個々の画像もすべて保存し、3D 解析に使用した。

2Dまたは3D画像セットからの測定値の生成

統合されたMetaXpress®ソフトウェアで利用可能な3D解析モジュールを用いて画像を解析した。定量的解析は、プロジェクション画像解析（2D）と3D解析の2つの方法で行った。2D最大プロジェクション画像（Hoechst染色とTuJ-1蛍光）は神経突起伸長アルゴリズムを用いて解析した。表現型の読み出しには、神経突起伸長、突起数と分岐数、細胞数と生存率の測定を含むマルチプレックス読み出しによる、神経ネットワークの広がりと複雑さの定量的特徴付けが含まれた。透過光画像の解析には、ベストフォーカス投影画像を使用した。プロジェクション画像の解析により、これらの表現型を迅速かつ正確に定量化することができる。図3は、透過光、蛍光（TuJ-1および核染色）、および神経突起伸長測定に使用した解析マスクを用いた神経細胞ネットワークの画像例である。

MetaXpress 3D解析モジュールは、異なる平面からの対物を組み合わせて、セルとネットワークの3D可視化を作成する。3D可視化は個々の細胞核（擬似色）とTuJ-1陽性神経突起および細胞体（緑）を表す（図4）。アウトグロースの神経突起伸長と細胞核の定義にはMetaXpressカスタムモジュールエディターを用いた。対物レンズはまず各平面で検出され、次に "connect by best match "機能を用いて3D空間で連結される。3D解析は、重なり合うオブジェクトを含む3Dマトリックスの体積全体にわたって、より正確なセルの定量を提供する。

3Dハイドロゲルを用いて化合物のスクリーニングが可能

表現型の読み出しには、マルチプレックス読み出しによる神経ネットワークの広がりと複雑さの定量的な特性評価が含まれる。アッセイの再現性を評価し、複数の測定を特徴付け、神経毒性物質として知られる一連の化合物をテストした。解析には、標準的な、神経突起伸長アルゴリズムを用いたプロジェクション画像の解析と、神経突起、枝、核を定義するカスタムモジュールを用いた3D解析の2つの方法を比較した。

ハイドロゲルで増殖させたセルをプレーティング後72時間目に化合物で処理し、処理後7～10日間の影響を測定することで、ハイドロゲルでの神経毒性研究の実行可能性を評価した（図5）。(図5）。化合物を加えた培養液は2日ごとに交換した。処理後、これらの培養を上記のように固定、染色、画像化した。その後、神経ネットワークに対する選択した化合物の濃度反応効果（神経突起伸長とその他のリードアウト）を測定した。これらの実験から、神経毒性評価にこのアッセイシステムを使用する概念実証が得られた。

まとめ

我々は、3D神経細胞培養における生存率と形態学的変化を評価できる定量的ハイスループット測定法を開発した。3DプロシードTMハイドロゲル、CNS.4UTMヒトiPSC由来神経細胞、および共焦点ハイコンテントイメージャーを用いたこの提案手法は、ハイスループット化合物毒性スクリーニングおよび安全性評価に使用できる。

高解像度の画像イメージングとマルチパラメトリック解析により、神経突起と単一細胞の計数が可能になり、3Dでの神経突起の発達と分岐を統計的に特徴付けることができる。2Dおよび3D解析を使用することで、IC50値の算出や様々な化合物の毒性の比較に使用できる定量的な測定値が得られる。

参考文献

1. Ehrbar, M.; Rizzi, S. C.; Hlushchuk, R. et al., Biomaterials 2007, 28 (26), 3856-66.
2. Simona B.R.ら、Biomater. Sci., 3:586-591, 2015.
3. Zhang N. & Milleret V., SLAS Discovery, accepted, 2017.
4. Sirenkoら、Assay and Drug Dev Technologies12(9-10):536-47

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