Application Note ヒトiPSC由来神経細胞培養液を用いた3Dマトリックスにおける
神経細胞発生の形態学的特性評価のためのハイコンテントアッセイ

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  • 化合物スクリーニングのための3D神経毒性アッセイの開発
  • ハイドロゲルとハイコンテントイメージャーを活用したハイスループット3D神経突起伸長アッセイ
  • IC50値を定義し、様々な化合物の毒性を比較するために使用できる定量的測定値を生成する。
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はじめに

化合物スクリーニングのための、より複雑で、生物学的に適切で、予測可能な細胞ベースアッセイの開発は、創薬における主要な課題です。トランスレーショナルバイオロジーを推進するために、3Dアッセイモデルの開発と統合が普及しつつあります。具体的には、3D培養は、構造、細胞組織、細胞-細胞間および細胞-マトリックス間の相互作用、より生理学的に関連した特性の拡散など、ヒト組織の側面を忠実に再現するという利点を提供します。

ハイドロゲルは、3D環境で神経細胞を増殖させるために、細胞外マトリックスをシミュレートするために広く用いられています。ハイドロゲルはポリ（エチレングリコール）（PEG）ベースで、完全に合成され、透明です。このハイドロゲルは、MMP切断可能な部位を封じ込め、細胞接着をサポートするRGDモチーフを含むことにより、細胞の遊走を許容するようになっています*1。この完全合成ハイドロゲルは、ハイドロゲル表面に沈着した細胞の3D的浸潤を促進する綿密な表面密度勾配を特徴とする96ウェルプレートにあらかじめキャストして開発されました（3DProSeedTMハイドロゲル、Ectica Technologies）。このハイドロゲル・プラットフォームは使用が簡単で、オートメーションに適合します*2,*3（図1）。

図1. 3DProSeedTMハイドロゲルの模式図とマトリックスへの神経細胞の播種。

ヒトiPS細胞由来の神経細胞は、ヒト由来であること、培養における生存率が長いこと、無制限に入手可能であることから、神経科学の応用において、初代細胞や動物モデルよりも有利です。

マルチウェルマイクロタイタープレートにおける3D神経突起ネットワークの形成

我々は、96ウェルフォーマットでの細胞培養と染色を最適化し、3Dマトリックスで増殖したニューロンの形態学的表現型と生存率を評価するための共焦点イメージングと解析プロトコルを開発しました。

アッセイに使用した細胞は、ニューロン（グルタミン酸作動性、ドーパミン作動性、GABA作動性）とアストロサイトからなるヒトiPSC由来細胞ミックスのCNS.4UTM（Axiogenesis AG）です。CNS.4UTM細胞は、3DProSeedTMハイドロゲル（Ectica Technologies）中で最長14日間培養しました。細胞は200μLの培地に40,000ニューロン/ウェルでプレーティングしました。一部の研究では、細胞播種密度の影響も評価しました（5,000-80,000細胞/ウェル）。培地組成は、ニューロベース培地＋DMEM/F12＋サプリメント（Axiogenesis）を50：50で混合したものでした。

細胞をハイドロゲル表面に播種し、ハイドロゲル内部に浸透させた（図1）。神経突起伸長はプレーティングの24時間後から形成され始め、14日間培養しました。神経突起ネットワークの形成は、透過光イメージングを用いて経時的にモニターしました。終点測定では、細胞を4％ホルムアルデヒドで固定した後、0.1％のTriton X-100で透過処理し、TuJ-1神経細胞マーカーに対する蛍光標識抗体とHoechst核染色を用いて染色しました。

画像のスタックから3D画像を生成

ハイコンテントイメージングと解析を用いて、神経細胞ネットワークの形成に対する治療効果を評価しました。焦点軸に沿った異なる平面で一連の画像を取得しました（Z-スタック）（図2）。画像はImageXpress®Micro Confocalハイコンテントイメージングシステムを用い、10Xまたは4X対物レンズで取得しました。5～10μm間隔で11～33面のZスタックを取得し、深さ150～300μmをカバーしました。2D プロジェクション画像（Maximum Projection または Best Focus）の自動保存に加え、個々の画像もすべて保存し、3D 解析に使用しました。

***図2. CNS.4UTM細胞を3DProSeedTM上に40,000cells/gelで播種し、14日後に共焦点イメージングモードで撮像したものです。核はHoechst（赤）とチューブリン-TuJ-1（緑）で染色しました。4つのパネルは異なる焦点面を示します。神経突起のネットワークはハイドロゲルの中に数百マイクロメートル広がっています。

2Dまたは3D画像セットからの測定値の生成

統合されたMetaXpress®ソフトウェアで利用可能な3D解析モジュールを用いて画像を解析しました。定量的解析は、プロジェクション画像解析（2D）と3D解析の2つの方法で行いました。2D最大プロジェクション画像（Hoechst染色とTuJ-1蛍光）は神経突起伸長アルゴリズムを用いて解析しました。表現型の読み出しには、神経突起伸長、突起数と分岐数、細胞数と生存率の測定を含むマルチプレックス読み出しによる、神経ネットワークの広がりと複雑さの定量的特徴付けが含まれました。透過光画像の解析には、ベストフォーカス投影画像を使用しました。プロジェクション画像の解析により、これらの表現型を迅速かつ正確に定量化することができます。図3は、透過光、蛍光（TuJ-1および核染色）、および神経突起伸長測定に使用した解析マスクを用いた神経細胞ネットワークの画像例です。

***図3. 2Dプロジェクション画像の解析。(上)*。
透過光プロジェクション画像と神経細胞検出のためのオーバーレイ解析マスク。CNS.4UTM細胞を3DProSeedTM上に異なる播種密度（5,000～80,000細胞/ゲル）で播種しました。細胞を14日間培養した後、ImageXpress® Micro Confocalシステムで染色とイメージングを行いました。3Dイメージング（Z-スタック画像取得）を行い、2Dプロジェクション画像を解析に用いました：蛍光イメージング画像は最大プロジェクション、透過光画像はベストフォーカス。解析では、細胞数、神経突起伸長（神経突起の長さ）、突起数と分岐数が自動的に測定されました。グラフは、プレーティングされた神経細胞数による様々な測定値の依存性を示しています。トリプリケートウェルからの平均値を示します。

MetaXpress 3D解析モジュールは、異なる平面からの対物を組み合わせて、セルとネットワークの3D可視化を作成します。3D可視化は個々の細胞核（擬似色）とTuJ-1陽性神経突起および細胞体（緑）を表します（図4）。アウトグロースの神経突起伸長と細胞核の定義にはMetaXpressカスタムモジュールエディターを用いました。対物レンズはまず各平面で検出され、次に "connect by best match "機能を用いて3D空間で連結されます。3D解析は、重なり合うオブジェクトを含む3Dマトリックスの体積全体にわたって、より正確なセルの定量を提供します。

図4. MetaXpress®ソフトウェアによるハイドロゲル中の細胞とネットワークの3D評価。(左上）3D可視化は細胞核（擬似色）とTuJ-1陽性の神経突起と細胞体（緑）を示します。(右上）個々の平面で定義されたアウトグロースの解析マスク。ウェルあたりの神経突起の数、神経突起の総体積、分岐点の数、細胞（核）の数を定義して3D解析を行いました。グラフはプレーティングした神経細胞数（トリプリケート）による測定値の依存性を示します。

3Dハイドロゲルを用いて化合物のスクリーニングが可能

表現型の読み出しには、マルチプレックス読み出しによる神経ネットワークの広がりと複雑さの定量的な特性評価が含まれます。アッセイの再現性を評価し、複数の測定を特徴付け、神経毒性物質として知られる一連の化合物をテストしました。解析には、標準的な、神経突起伸長アルゴリズムを用いたプロジェクション画像の解析と、神経突起、枝、核を定義するカスタムモジュールを用いた3D解析の2つの方法を比較しました。

ハイドロゲルで増殖させた細胞をプレーティング後72時間目に化合物で処理し、処理後7～10日間の影響を測定することで、ハイドロゲルでの神経毒性研究の実行可能性を評価しました（図5）。(図5）。化合物を加えた培養液は2日ごとに交換しました。処理後、これらの培養を上記のように固定、染色、画像化しました。その後、神経ネットワークに対する選択した化合物の濃度反応効果（神経突起伸長とその他のリードアウト）を測定しました。これらの実験から、神経毒性評価にこのアッセイシステムを使用する概念実証が得られました。

図5. 化合物の用量反応の測定。播種後72時間目に、神経毒性作用が知られている3種類の化合物を、0～10μMの範囲で濃度を変えて神経細胞培養液に添加しました。(上図）化合物の神経突起発達抑制効果が容易に可視化されます。(上図）2D圧縮画像（最大投影）を解析に用いました。メチル水銀（IC50 5 nM）、ディルドリン（IC50 170 nM）、ロテノン（IC50 220 nM）の神経突起伸長に対する濃度反応曲線を示します。IC50値は、3D解析および既報のデータ4と同程度でした。 下段グラフ）3D解析結果。神経突起の総体積を測定しました。メチル水銀（赤、IC50 2 nM）、ディルドリン（青、IC50 170 nM）、ロテノン（緑、IC50 750 nM）。

まとめ

私達は、3D神経細胞培養における生存率と形態学的変化を評価できる定量的ハイスループット測定法を開発しました。3DプロシードTMハイドロゲル、CNS.4UTMヒトiPSC由来神経細胞、および共焦点ハイコンテントイメージングを用いたこの提案手法は、ハイスループット化合物毒性スクリーニングおよび安全性評価に使用できます。

高解像度の画像イメージングとマルチパラメトリック解析により、神経突起と単一細胞の計数が可能になり、3Dでの神経突起の発達と分岐を統計的に特徴付けることができます。2Dおよび3D解析を使用することで、IC50値の算出や様々な化合物の毒性の比較に使用できる定量的な測定値が得られます。

参考文献

  1. Ehrbar, M.; Rizzi, S. C.; Hlushchuk, R. et al., Biomaterials 2007, 28 (26), 3856-66.
  2. Simona B.R.ら、Biomater. Sci., 3:586-591, 2015.
  3. Zhang N. & Milleret V., SLAS Discovery, accepted, 2017.
  4. Sirenkoら、Assay and Drug Dev Technologies12(9-10):536-47

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