Application Note 幹細胞由来心筋細胞を用いた
ハイスループット心毒性アッセイ

はじめに

心臓毒性は、臨床試験で失敗する新薬の大きな割合を占めている。ハイスループット・スクリーニングに適した予測性の高いin vitroアッセイの開発は、心臓安全性化合物の失敗に関する非効率性と高コストを改善するために不可欠である。従来の心毒性化合物の特性評価法は、手間がかかり、時間もかかる。手作業によるパッチクランピングや自動電気生理学は、個々のセル上の単一チャネルの解析に限られており、ハイコストでスループットが低い。その他のハイスループットな方法では、解析のためにデータを複雑なソフトウェアにエクスポートするか、時間のかかる手動解析を行う必要があります。FLIPR® Tetraシステム上で動作するScreenWorks® Peak Pro™ ソフトウェアを使用すれば、幹細胞由来の心筋細胞を用いて心毒性化合物の特性を迅速かつ容易に解析することができます。幹細胞由来のヒト心筋細胞は、現在利用可能なものよりも生物学的に適切な細胞ベースモデルを提供することにより、新規化学物質の開発を大幅に加速し、薬剤の安全性を向上させることができます。心筋細胞をScreenWorks Peak ProソフトウェアおよびFLIPR Tetraシステムと併用することで、創薬プロセスの早い段階で毒性および有効性を予測するためのロバストなハイスループット手法を提供する統合ソリューションが得られます。特異性のある化合物をより早く失敗させたり、さらにモニタリングしたりすることができ、前臨床試験に進める最も有望なリード物の優先順位をより明確にすることができます。

ハイスループットFLIPR Tetraシステム心臓拍動アッセイ

FLIPR Tetraシステムは、GPCRおよびイオンチャネル受容体に対する早期リード化合物を同定するための柔軟で信頼性の高いリアルタイムカイネティックセルラーアッセイスクリーニングシステムです。また、FLIPR®カルシウム5アッセイキットを用いて、心筋細胞の収縮に伴う細胞内Ca2+フラックスの変化をモニターすることもできます。このアッセイでは、人工多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞（セルラー・ダイナミクス・インターナショナル社提供）にFLIPRカルシウム5アッセイキットの色素を負荷し、拍動する細胞への化合物の影響をモニターすることができます。FLIPR Tetraシステムは、96、384、または1536ウェルから読み取りながら試薬と化合物を同時に自動添加することができ、異なる時点で読み取ることによって生じるウェル間のばらつきを低減できるため、心拍動アッセイに有利です。図1 (2ページ)に示すように、心拍細胞に対する化合物の効果を解析し可視化するための時間応答曲線は、1プレートあたり約2分で取得できます。

ScreenWorks Peak Pro ソフトウェアによる自動ピーク分析

大量の化合物のアッセイを行うには、自動データ解析が必須である。384個のトレースを手作業でカウントすると、セルビート解析は少数のパラメーターに制限され、時間がかかり、人為的ミスの可能性がある。解析のためにデータを別のプログラムにエクスポートすると、情報の質や、真の自動化とハイスループットを必要とする環境での有用性を損なうステップが追加されます。ScreenWorks Peak Proソフトウェアは、FLIPR Tetraシステムですでに実行されているデータ収集および解析プログラムに統合されています。このソフトウェアの使いやすいインターフェースと直感的なセットアップにより、自動測定の精度を保ちながら、ウェルごとに迅速かつ再現性の高い結果が得られます。

信号のピークパラメーターは、動的しきい値と微分解析に基づいて計算され、図2に示すように、振幅、時間、周波数、レート、幅の値を提供する。

図3は、毒性の可能性がある薬剤候補を同定するためのScreenWorks Peak Proソフトウェアの利点を示しています。cisaprideのデータでは、拍動率の低下、減衰率の増加、および10%におけるピーク幅の増加が示されており、これらはすべてQT延長症候群の予測である可能性があるため、心臓安全性に影響を及ぼす可能性があります。創薬プロセスの早い段階でこれらのパラメーターを特定できれば、その化合物が前臨床試験の失敗候補であることを示す可能性がある。

予測的HT細胞ベースアッセイ

より強力で安全な新薬の開発には、有効性と安全性を試験できるin vitroシステムが必要である。臨床では、心不全、頻脈、不整脈、その他の心疾患を治療するために、陽性および陰性クロノトロピックが使用されている。FLIPR Tetraシステムを用いたアッセイから、いくつかの陽性および陰性クロノトロピン、および既知のイオンチャネル遮断薬が心拍数に及ぼす影響が示された。EC50値は予想される範囲であった（図4参照）。(図4参照）hERGチャネルブロッカーであるシサプリドを含むこの化合物群は、ScreenWorks Peak Proソフトウェアを使用して解析されました。Cisaprideのデータは、拍動速度の低下と10%振幅でのピーク幅の増加を示しており、いずれも心臓に悪影響を及ぼす可能性のある指標である。

結論

FLIPR Tetraシステムは、ScreenWorks Peak ProソフトウェアおよびFLIPR Calcium 5アッセイキットとともに、創薬プロセスの早い段階で心毒性化合物を排除し、潜在的な心疾患治療薬の候補を同定することで、創薬デザインを方向付けるための完全な統合ソリューションを提供します。