Application Note DNA損傷のハイスループットRNAiスクリーニング

はじめに

RNA干渉（RNAi）ライブラリーとハイスループット細胞ベースアッセイを組み合わせることは、薬剤感受性と耐性の新規メカニズムを同定するための魅力的な戦略である。例えば、非小細胞肺癌細胞をパクリタキセルに感作させる遺伝子を同定したゲノムワイドRNAiスクリーニングの研究が報告されている（Whitehurstら、Nature 446, 815-819, 2007）。この研究は、がん細胞の有糸分裂進行に重要な新規標的を同定するRNAi技術の可能性を示した。ブルーシフト・バイオテクノロジーズ社（BBI）は、高速データ作成のための画像取得と解析モジュールが統合された強力な新しいスクリーニング・プラットフォーム、ImageXpress® Velosシステムを開発した。アプリケーションノートNo.8では、パクリタキセルが有糸分裂細胞に及ぼす影響を、リン酸化ヒストンH3とDNA含量の免疫蛍光検出によって同定する、迅速で簡便な有糸分裂指標アッセイを報告した。ここでは、リン酸化ヒストンH2AXとDNA含量の免疫蛍光検出に基づくDNA損傷の2色アッセイの開発について報告する。ヒストンH2AXのセリン139上でのリン酸化は、薬物や電離放射線によって生じるDNA二本鎖切断の初期事象であり、感度の高い指標であることが示されている。また、この2色DNA損傷アッセイは、RNAiスクリーニングのための高感度かつ迅速な自動化プロセスであり、この方法が標的探索の取り組みに有用であることを示す。アッセイのセットアップを図1に示す。

アッセイ手順

セルと培養条件

HeLa細胞は10% FCS添加DMEMで培養した。細胞は384ウェル、黒壁、透明底ポリスチレンプレート（Greiner社製）に600細胞/ウェルの密度でプレーティングした。

ImageXpress VelosシステムによるDNA損傷の検出

RNAiおよび/またはDNA損傷剤処理後、細胞を固定、透過化し、ヒストンH2AXのSer139のリン酸化に対する抗体（細胞シグナリング）で免疫染色した。抗ウサギAlexa Fluor-488（AF488、Invitrogen）標識二次抗体で一次抗体を検出し、ヨウ化プロピジウム（PI）ですべての核を同定した。ImageXpress Velosレーザースキャニングプラットフォームは、緑（Ch1, 510-540nm BP）と赤（Ch3, 600nm LP）のフィルターチャンネルを持つ2チャンネル取得用にセットアップされた。画像取得は10 x 10ミクロンサンプリングで行った。ウェル全体の画像は、赤色チャンネルで細胞を同定し、緑色チャンネルと赤色チャンネルのバックグラウンド補正積分蛍光強度を用いて、細胞ごとに解析した。陽性対照ウェルと陰性対照ウェルの代表画像を図2に示す。

結果と考察

ハイスループットDNA損傷アッセイの自動化

Twister IIマイクロプレートハンドラー（キャリパー社）と統合したImageXpress Velosシステム-HTSを、20,000を超えるRNAiライブラリーのスクリーニングに使用した（スタンフォード大学Karlene Cimprich研究室との共同研究）。このプラットフォームは、ウォークアウェイ自動画像取得と、2色画像処理プロセスによるDNA損傷の自動細胞定量を可能にした。図2の陰性対照処理サンプルと陽性対照処理サンプルの細胞のリン酸化H2AXとPI染色の2パラメータドットプロット結果を図3に示す。このドットプロットは、BBIが開発したExcelマクロを用いて作成した。紫色の分割線はCh3/Ch1比を表し、X軸の切片は自動DNA損傷定量に使用する設定を定義するために調整可能である。陰性対照サンプルは1.9％、陽性対照（以前DNA損傷を増加させることが示されたRNAi）は88.5％であった。

代表的な384ウェルプレートで得られたDNA損傷率の結果を図4に示す。陰性コントロールのウェル（n=8）は灰色で、陽性コントロールのウェル（n=8）は緑色で示した。典型的なZ'-prime値は0.9であった。その他のウェルはすべてRNAiで処理し、値が13.5%以上のウェルはオレンジ色で示した。

結論

ヒストンH2AXのリン酸化は、薬剤や電離放射線によって生じたDNA二本鎖切断の鋭敏な指標であることが示されてきた。本報告では、ImageXpress Velos-HTSレーザースキャニングプラットフォームが、DNA損傷定量用のハイスループット2色アッセイをどのように可能にしたかを示した。また、この2色DNA損傷アッセイが、DNA損傷剤に対してがん細胞を感作する遺伝子を同定するためにデザインされたRNAiスクリーニングにおいて、高感度で高速な自動化プロセスであることも実証した（原稿準備中）。本プラットフォームのユニークな光学系とスキャニングエンジンにより、シンプルな "プラグ・アンド・プレイ "アプリケーションが可能になり、学術界と産業界の両方のライフサイエンス研究者のニーズに応えることができる。