Application Note 均一系細胞毒性アッセイ
ハイスループット評価に最適

ToxCount™（検証済みアッセイ）

はじめに

細胞の健全性を評価するアッセイは、創薬スクリーニング環境において重要です。Active Motif社（Carlsbad, CA）のToxCount™ Cell Viabilityアッセイキット（Cat. #18010）は、細胞集団の生存率を判定するためのシンプルな2色アッセイです。このキットは、細胞内エステラーゼ活性と細胞膜の完全性に基づいてライブセルを識別し、細胞膜の損傷によって死細胞を識別します。ほとんどの真核細胞タイプに適用可能であり、検証済みです。 ライブセルでは、細胞内エステラーゼ活性により非蛍光の細胞透過性calcein AMが蛍光性calceinに変換され、最大発光波長は515 nmです。死細胞では、Ethidium homodimer-1（EthD-1）が損傷した膜を通過して細胞内に入り、核酸に結合することで蛍光が増強され、最大発光波長635 nmの明るい赤色核蛍光を発します。EthD-1は、生細胞の完全な細胞膜によって排除されます。 ImageXpress Velosシステムは、迅速・簡便・ハイスループットな均一系（洗浄不要）細胞毒性アッセイに理想的なプラットフォームです。ここでは、ハイスループット条件下で自動ToxCount™アッセイ解析に重要な柔軟性を備えた統合画像取得・解析モジュールを紹介します。

アッセイ手順

HeLa細胞を、黒壁透明底の96ウェルポリスチレンプレートに1ウェルあたり2,500細胞（50 µL培地）で播種し、37°C、5％CO₂インキュベーターで一晩培養しました。培地を除去後、PBSまたは血清なしMEM中のサポニンを各濃度で添加し（50 µL/well）、37°C、5％CO₂で30分間処理しました。処理後、calcein AMとEthD-1（両方0.5 µM、50 µL/well）で染色し、37°Cで30分間インキュベートしました。各96ウェルプレートは、5×5 µmサンプリングで4分以内にスキャンしました。

結果と考察

ImageXpress® Velosシステムは488 nmレーザーで構成されました。calcein（緑）の蛍光はCh1（510–540 nmバンドパスフィルター）で、EthD-1（赤）はCh3（600 nmロングパスフィルター）で検出しました。96ウェルプレートをImageXpress Velosシステムにセットし、PMTゲイン、細胞カウント条件、生死判定基準を含むすべてのデータ取得・処理設定はToxCount™メソッドで自動構成されました。画像解析はスキャンと同時に行われ、結果は即座に表示できます。結果は、各ウェルの細胞ごとのデータを列挙したCSVファイルと、ライブセル率、死細胞率、ライブセル数、死細胞数をプレートレイアウト形式で示すサマリーテキストファイルとして保存されます。

ライブセルおよび死細胞のコントロール群のウェル全体画像は図1に示します。細胞ごとの散布図は図2に示し、両群間で優れた識別が確認されました。Ch1/Ch3比が0.53より大きい細胞はライブセル、0.53未満の細胞は死細胞として分類されます。この比率は図2のプロットでマゼンタ線として表示されています。細胞毒性アッセイにおけるライブセルと死細胞の数の定量は、calcein信号（Ch1）とEthD-1信号（Ch3）の比率を比較することで行います。図3には、サポニン処理後のライブセル率を示すプレート形式のヒートマップを示します。図4には、サポニンの濃度依存効果を示します。

結論

ImageXpress VelosシステムのスキャニングプラットフォームとBlueImage細胞解析ソフトウェアは、ToxCount™ Cell Viabilityアッセイキットを用いた細胞毒性研究において有効であることが示されました。結果は、HeLa細胞においてcalcein AMとEthD-1の染色濃度を最終濃度0.5 µMまで低減できることを示しています。均一系フォーマットでウェル全体をハイスループットスキャンできる能力により、細胞単位の細胞毒性アッセイを一次スクリーニングとして実施できます。ImageXpress Velosシステムは、細胞毒性スクリーニングアッセイの定量化をよりユーザーフレンドリーにしたい研究室にとって魅力的なソリューションです。ここで示したToxCount™アッセイのように、ImageXpress Velosシステムは、ハイスループット条件下で画像解析手順の開発・実行・検証に重要な柔軟性を備えた統合画像取得・解析モジュールを提供します。このプラットフォームの独自の光学系とスキャニングエンジンにより、学術研究と産業研究の両方のニーズに応えるシンプルな「プラグアンドプレイ」アプリケーションが可能になります。

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