Application Note SpectraMax M5eプレートリーダーでの
HTRF cAMP dynamic 2およびIP-Oneアッセイ
- デュアルモノクロメーターベースのシステムの柔軟性
- 広いダイナミックレンジと優れたZ'ファクター
- SoftMax Proソフトウェアによる設定済みHTRFプロトコル
PDF版（英語）
はじめに
SpectraMax®M5eマルチモードマイクロプレートリーダーは、蛍光、時間分解蛍光（TRF）、蛍光偏光、吸光度、ルミネッセンスアッセイが可能なデュアルモノクロメーターです。HTRF®（ホモジニアス時間分解蛍光）認証も取得しており、ライフサイエンスや創薬の研究者はTRF検出の柔軟性を高めることで生産性を向上させることができます。
HTRFは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)とTRFの特徴を併せ持ち、ドナー蛍光体としてユーロピウム(Eu)クリプテートを、アクセプター蛍光体として修飾アロフィコシアニン(XL665)または低分子d2を使用します。相互作用する生体分子をクリプ酸ユーロピウムとd2で標識すると、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアの間でFRETが起こり、665 nmでモニターされる蛍光発光が生じる一方、クリプ酸の励起エネルギーの大部分は620 nmの蛍光発光として放出されます。ウェル間のばらつきは、665 nm と 620 nm の蛍光シグナルの比を利用するシスビオの特許取得済み HTRF 比計算を使用することで補正されます。
SpectraMax M5eプレートリーダーでのHTRFアッセイ性能は、2 種類の HTRF アッセイキット、cAMP dynamic 2 と IP-One で実証されています。G タンパク質共役型受容体は、cAMP の調節と IP3 を介した細胞内カルシウム濃度の上昇という 2 つの主要な経路を通じてシグナルを伝達します。cAMP dynamic 2キットでは、Euクリプテート標識抗cAMPモノクローナル抗体とd2標識cAMPを用いてcAMPレベルを検出します。細胞で産生されたネイティブcAMPは、cAMP-d2と競合して抗cAMP抗体-クリプテートに結合します。細胞内cAMPの増加はFRETの減少につながり、それは665 nmにおける蛍光の減少として検出可能です。IP-Oneアッセイも同様の形式で、IP1に特異的なモノクローナル抗体を使用します。IP1は、塩化リチウム存在下でシグナル伝達細胞内に蓄積するIP3のより安定な下流代謝物です。665nmにおける蛍光は、キャリブレーターまたは細胞溶解液中のIP1濃度に反比例します。本アプリケーションノートでは、細胞ベースのアッセイデータと、cAMP dynamic 2およびIP-Oneキットで作成した標準曲線の両方を紹介します。これらのHTRFデータは、SpectraMax M5eプレートリーダーで得られる優れたダイナミックレンジとZ'ファクター2を示している。
材料
- cAMP dynamic 2 キット、1000 テスト（Cisbio）
- IP-One キット、1000 テスト（Cisbio）
- 細胞株 CHO-M1 (M1WT3; ATCC)
- フォルスコリン（Sigma）
- 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX；Sigma）
- 塩化カルバモイルコリン（カルバコール；Sigma）
- 白色384ウェルマイクロプレート（コーニング社）
- SpectraMax M5e マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
注意：SpectraMax M5eプレートリーダーでHTRFアッセイを行う場合は、必ず白色マイクロプレートを使用してください。シグナルの検出を最適化するには、底が透明なマイクロプレートではなく、白色の固形マイクロプレートを使用してください。
方法
cAMP dynamic 2アッセイ
CHO-M1細胞は、10%FBS、\( 1\% \text{ penicillin/streptomycin/L-glutamine} \)、\( \frac{200\,\mu\mathrm{g}}{\mathrm{mL}} \) G418を添加したHam's F12培地で培養しました。cAMP dynamic 2アッセイは、懸濁状態の細胞で行いました。細胞は、アッセイ当日にトリプシン処理し、無添加のHam's F12培地に再懸濁し、白色384ウェルマイクロプレートに1ウェル当たり10μLの容量で4,000個ずつ播種しました。cAMP産生を刺激するため、検出試薬を添加する前に、最終濃度3nM～1mMのフォルスコリン10μLで細胞を1時間処理しました。ホスホジエステラーゼによるcAMP分解を阻害するため、IBMXを0.5 mMでアッセイウェルに添加しました。
フォルスコリン処理1時間後、cAMP-d2コンジュゲートと溶解バッファー、および抗cAMP抗体クリプテートを、製品添付文書に記載されているように細胞に添加しました。未処理細胞を含む陰性対照細胞には、抗cAMP抗体-クリプテート、cAMP-d2を含まないコンジュゲートおよび溶解バッファーが添加されました。この FRET 陰性コントロールは、HTRF の添付文書3 に概説されていますように、ΔF 値を算出するために必要でした。すべてのサンプルと標準物質の最終アッセイ量は 40 µL でしたが、アッセイ量はマイクロプレートの種類に応じて調整することができます。
cAMPの標準品はcAMP dynamic 2 HTRFの添付文書に記載されている方法で調製しました。cAMPの最終濃度は0.17～712 nMで、cAMPを含まない陽性対照（FRETが最大）も含まれました。遊離cAMPからなるcAMPコントロールはアッセイ活性をモニターするために使用し、cAMPまたはcAMP-d2を含まない陰性（FRETなし）コントロールはΔFを計算するために使用しました。抗cAMP抗体クリプテートをすべての標準品とコントロールに添加しました。室温で1時間インキュベートした後、マイクロプレートをSpectraMax M5eプレートリーダーで読み取りました。(装置の設定については表1を参照）。
IP-Oneアッセイ
CHO-M1細胞を上記のように培養しました。アッセイ前日、完全増殖培地中で、1ウェルあたり10,000～40,000個の細胞を384ウェルマイクロプレートに播種しました。翌日、細胞をカルバコール濃度15 nM～33 μMで刺激しました（カルバコール濃度の調製には塩化リチウムを含む刺激バッファーが使用されました）。1時間の刺激の後、コンジュゲートと溶解バッファー中のIP1-d2、および抗IP1抗体クリプテートをウェルに添加しました。未処理の細胞を含むネガティブコントロールには、IP1-d2を含まない抗IP1抗体クリプテートとコンジュゲートおよび溶解バッファーが添加されました。最終的なアッセイ量は40μLでしたが、cAMPアッセイと同様に、この量はマイクロプレートの種類に応じて調整することができます。
最終濃度 21.5～22,000 nM の IP1 標準物質は、IP-One HTRF の添付文書に記載されているように、再構成 IP1 標準物質を刺激バッファーで希釈して調製しました。IP1-d2 はすべての標準品と IP1 陽性対照に添加し、陰性対照には IP1-d2 を含まないコンジュゲートと溶解バッファー を添加しました。抗IP1抗体-クリプテートを全サンプルに添加しました。室温で1時間インキュベートした後、マイクロプレートをSpectraMax M5eプレートリーダーで表1に示す設定で読み取った。
| 読み取りタイプ | エンドポイント | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 読み取りモード | 時間分解 遅延 50 統合 400 トップリード |
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| 波長 |
|
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| 感度 |
読み取り値 100 PMT: オート |
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| オートキャリブレーション | オン | ||||||||||||
| セットリング時間 | オフ | ||||||||||||
| キャリッジ速度 | Normal | ||||||||||||
表1. SpectraMax M5eプレートリーダーの装置設定
データ解析
cAMPアッセイとIP-Oneアッセイのデータは、Cisbio社のガイドラインに従い、SoftMax®Proソフトウェアを用いて解析しました。SoftMax Proソフトウェアの4つの異なるHTRFプロトコールは、現在利用可能なあらゆるタイプのHTRFアッセイのデータ取得と解析を簡素化するように設計されています。
FRETは以下のように計算されました：
\[ \text{Ratio} = \left( \frac{\text{Signal}_{665\ \mathrm{nm}}}{\text{Signal}_{620\ \mathrm{nm}}} \right) \times 10000 \]
\[ \Delta\ \text{Ratio} = \text{Standard or Sample Ratio} - \text{Ratio}_{\text{neg}} \]
(ここで、Rationegは陰性コントロールの比率)
\[ \Delta F\% = \left( \frac{\Delta R}{\text{Ratio}_{\text{neg}}} \right) \times 100 \]
装置の設定
波長、遅延および積分設定は、デュアルモノクロメーターベースのSpectraMax M5eプレートリーダー用に最適化されています。特に、\( \frac{\text{XL665}}{\text{d2}} \) ドナーの最適な発光波長は、HTRF 製品情報に記載されている 665 nm ではなく、668 nm と決定されました。
結果
cAMP細胞を用いたアッセイでは、384ウェルマイクロプレート（最終アッセイ量40 µL）に1ウェルあたり約4,000個のCHOM1細胞を用いた場合に最良の結果が得られました。最適な細胞密度は、細胞の種類や特定のアッセイ条件によって異なる可能性があります。細胞をフォルスコリンで1時間処理すると、EC₅₀が11.4 µM、Z'ファクターが0.86の用量反応曲線が得られました（図1）。シスビオのレシオメトリック公式を用いて算出したΔF%値は47～707（表2）であり、cAMP標準曲線で観察された範囲と同様でした（図2、表3）。
図1. cAMP細胞ベースアッセイ CHO-M1細胞におけるフォルスコリンの用量反応（Z'=0.86、EC₅₀=11.4 µM）。
| フォルスコリン (µM) | 平均比率 | SD 比率 | CV % 比率 | 平均デルタ F% |
|---|---|---|---|---|
| 1000.000 | 762 | 30.7 | 4.0 | 47 |
| 200.000 | 951 | 29.2 | 3.1 | 83 |
| 40.000 | 1633 | 84.3 | 5.2 | 215 |
| 8.000 | 2623 | 137.7 | 5.3 | 406 |
| 1.600 | 3508 | 134.5 | 3.8 | 576 |
| 0.320 | 3854 | 303.3 | 7.9 | 643 |
| 0.064 | 4008 | 106.7 | 2.7 | 673 |
| 0.013 | 4186 | 154.0 | 3.7 | 707 |
| 0.003 | 4185 | 133.6 | 3.2 | 707 |
| 0 | 4459 | 204.3 | 4.6 | 760 |
表2. cAMPセルベースアッセイデータのまとめ
図2 cAMP標準曲線（Z'=0.84、EC₅₀=6.3 nM、添付文書に記載された値と同等）。
| cAMP (nM) | 平均比率 | SD 比率 | CV % 比率 | 平均デルタ F% |
|---|---|---|---|---|
| 712.0 | 515.2 | 22.8 | 4.4 | 5.4 |
| 178.0 | 674.9 | 12.6 | 1.9 | 38 |
| 44.5 | 1089.9 | 59.8 | 5.5 | 122.9 |
| 11.1 | 2088.7 | 149.5 | 7.2 | 327.2 |
| 2.8 | 3166.8 | 83.6 | 2.6 | 547.7 |
| 0.7 | 3910.1 | 190.9 | 4.9 | 699.7 |
| 0.2 | 4341 | 98.6 | 2.3 | 787.8 |
| 0 | 4610.1 | 227.9 | 4.9 | 842.9 |
表3. cAMP dynamic 2 assay標準曲線データのまとめ
IP-One 細胞ベースのアッセイでは、至適細胞密度は 384 ウェルマイクロプ レートのウェルあたり 10,000 CHOM1 細胞としました（最終アッセイ容量は 40 µL）。カルバコールで1時間刺激すると、EC₅₀が0.64μM、Z'ファクターが0.91の用量反応曲線が得られました（図3）。シスビオの比抵抗式で計算したデルタF%値は3402から12539の範囲でした（表4）。(表4）。
図3. IP1セルベースアッセイ CHO-M1細胞におけるカルバコール用量反応曲線（Z'=0.91、EC₅₀=0.64 µMカルバコール）。
| カルバコール (µM) | 平均比 | SD 比 | CV % 比 | 平均デルタ F% |
|---|---|---|---|---|
| 100.00 | 3402 | 141.5 | 4.2 | 463 |
| 33.33 | 3538 | 68.8 | 1.9 | 486 |
| 11.11 | 3646 | 42.7 | 1.2 | 503 |
| 3.7 | 4105 | 25.5 | 0.6 | 579 |
| 1.23 | 5720 | 120.3 | 2.1 | 847 |
| 0.41 | 9517 | 143.6 | 1.5 | 1476 |
| 0.14 | 11733 | 397.9 | 3.4 | 1843 |
| 0.05 | 12234 | 424.1 | 3.5 | 1926 |
| 0.02 | 12357 | 139.2 | 1.1 | 1946 |
| 0 | 12539 | 102.1 | 0.8 | 1976 |
表4. IP-One セルベースアッセイデータの要約
IP-One HTRF の添付文書に従って IP1 標準物質を調製したところ、Z'ファクターが 0.84（図 4）、 デルタ F%値が 820 から 11883 の範囲の検量線が得られました（表 5）。
図4. IP1標準曲線 Z'=0.84、EC₅₀=501 nM、添付文書に記載された値と同等。
| カルバコール (µM) | 平均比 | SD 比 | CV % 比 | 平均デルタ F% |
|---|---|---|---|---|
| 30800 | 820 | 28.6 | 3.5 | 44 |
| 7700 | 1389 | 71.0 | 5.1 | 144 |
| 1925 | 3011 | 127.7 | 4.2 | 429 |
| 481 | 6348 | 238.7 | 3.8 | 1015 |
| 120 | 9668 | 334.6 | 3.5 | 1598 |
| 30 | 11157 | 551.1 | 4.9 | 1860 |
| 0 | 11883 | 566.3 | 4.8 | 1987 |
表5. IP-one標準曲線データのまとめ
結論
HTRF認証付きSpectraMax M5eマルチモードマイクロプレートリーダーは、デュアルモノクロメーターベースのシステムの柔軟性と複数の検出モードの汎用性を求める研究者が利用できるアッセイ法の幅を広げます。SpectraMax M5eプレートリーダーでIP-OneおよびcAMP HTRFアッセイを実行すると、広いダイナミックレンジと0.78～0.91の優れたZ'ファクターを示します。データ解析は、HTRFプロトコルがあらかじめ設定されたSoftMax Proソフトウェアを用いて簡便に行えます。
参考文献
- TR-FRET Basics (HTRF Technology)
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., and Oldenburg, K. R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol Scrn 4(2): 67-73.
- cAMP dynamic 2 HTRF kit package insert (Cisbio international, France).
- IP-One HTRF kit package insert (Cisbio international, France).
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