Application Note BSAコンタミナントアッセイ

はじめに

Bovine serum albumin（BSA）は 63,000 ダルトンのタンパク質で、ウシ血清の主要成分となります。BSA を含む胎仔ウシ血清は、組換え医薬品の製造に用いられる哺乳類細胞培養培地として使用できます。組換え医薬品の精製過程において、BSA が目的タンパク質とともに共精製される可能性があり、臨床使用において生物学的ハザードとなり得ます。そのため、哺乳類細胞由来の最終製品における BSA のコンタミナントをアッセイすることが必要となります。また、BSA のアッセイは、製造プロセス全体を通じて目的タンパク質の精製状況をモニタリングするためにも利用できます。

本アプリケーションノートでは、市販の抗 BSA 抗体を用いた BSA アッセイの予備的なプロトコールおよび性能を示しています。本ノートはあくまでガイドとして提供するものであり、本アッセイのバリデーションや、必ずしも最適な性能パラメーターを示すものではありません。

材料

1. Molecular Devices Corporation製 Threshold® System（カタログ番号 #0200-0500）、1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089、Tel: 408-747-1700 または 800-635-5577。
2. Molecular Devices Corporation製 Immuno-Ligand Assay Labeling Kit（カタログ番号 #R9002）。
3. Molecular Devices Corporation製 Immuno-Ligand Assay Detection Kit（カタログ番号 #R9003）。
4. 注：ILA キットに含まれる Assay Buffer Concentrate は、BSA コンタミナントアッセイでは一切使用しません。これは、アッセイバッファに BSA が含まれており、アッセイに干渉するためです。
5. BSA を含まないアッセイバッファの配合組成は以下のとおりです

1. BSA フリーアッセイバッファの 10X 溶液を脱イオン水で 1:10 に希釈し、500 mL の 1X 溶液を調製します。 その後、0.22 µm フィルターでろ過してください。10X ストック溶液は 4°C で保存します。 結晶が形成された場合は、1X 溶液を調製する前に室温まで温めて溶解してください。 バッファのコンタミネーションを防ぐため、個包装の滅菌ピペットチップのみを使用し、ガラス器具は脱イオン水で十分に洗浄したものを使用します。
2. BSA（フラクション V）は Boehringer Mannheim（catalog #100 350）から購入しました。 他の BSA 供給元（Boehringer Mannheim Molecular Biology grade、Pentex Miles Reagent Preparation grade、Sigma RIA grade）でも試験を行い、同等の結果が得られています。
3. オーバルブミンは Sigma Chemical Co.（catalog #A-5503）から購入しました。
4. 抗 BSA アフィニティ精製ポリクローナルチキン抗体は O.E.M. Concepts（Toms River, New Jersey, tel: 908-341-3570）から購入しました。
5. Sephadex® G-25 カラムは Pharmacia Biotech（PD-10, catalog #17-0851-01）から購入しました。
6. サンプルは Molecular Devices Corporation の顧客よりご提供いただいたものです。

方法

抗体の標識および保存

チキン由来の抗 BSA 抗体は、Threshold System Operator’s Manual の ILA セクションおよび ILA アプリケーションノート Optimizing the labeling of proteins に記載されている方法に従って標識しました。

チキン由来の抗 BSA 抗体は、標識前に 4°C にて一晩、PBS を対照液として透析し、アジ化ナトリウムを除去しました。DNP‑biotin‑NHS あるいは fluorescein‑NHS ハプテンは、1 mg/mL の抗体溶液 250 µL に対して室温で 2 時間、遮光条件下でインキュベートしました。モル結合比（MCR）は、タンパク質 1 モルあたりにインキュベートしたビオチンまたはフルオレセインのモル数として定義されます。本実験で使用した MCR は 20:1 です。

未反応のハプテンは、25 mL の PBS で平衡化した Pharmacia 製 PD‑10 カラムに反応溶液を通すことで、抗体から分離しました。タンパク質濃度、タンパク質回収率、およびモル導入比（MIR）は、Threshold System Operator’s Manual の ILA セクションに記載されている方法に従って算出しました。MIR は、タンパク質 1 モルあたりに共有結合したハプテンの平均モル数として定義されます。

以下の表には、4 回の独立した標識反応で得られたモル導入比を示します。3 種類の異なるロットの抗体を使用しました。抗体のストック濃度は約 1 mg/mL でした。

標識後、抗体は BSA フリーアッセイバッファに 1 mg/mL のオーバルブミン（キャリアタンパク質）を加え、10 µg/mL に希釈しました。150 µL ずつ分注し、滅菌済みの Sarstedt チューブに入れて −20°C で保存しました。

注意：抗体をピペット操作する際は、個包装の滅菌ピペットチップを使用してください。

各測定における抗体の最適濃度の決定（ローディングスタディ）

ビオチン化およびフルオレセイン化した抗 BSA 抗体の 4 種類の濃度（10、20、30、40 ng/測定）について、BSA の 3 種類の濃度（0、200、2000 pg/mL）と組み合わせて評価し、バックグラウンドレートおよびスロープを測定しました。スロープは、濃度変化に対するシグナル変化量を示す指標です。サンドイッチフォーマットと、修正した同時インキュベーションプロトコルを使用しました（詳細は Threshold System Operator’s Manual の ILA セクションを参照）。

ビオチン化およびフルオレセイン化した抗 BSA 抗体を 20 ng/測定（200 ng/mL）で使用した場合、BSA が存在しない条件（0 pg/mL BSA）で最も低いバックグラウンドシグナルが得られ、BSA が存在する条件（200 および 2000 pg/mL BSA）では最大のレートが得られました。30 または 40 ng/測定の抗体を使用した場合に観察された µV/sec シグナルが 20 ng/測定より低かったのは、フルオレセイン化抗体量が測定あたりの Enzyme Reagent の量を上回ったためです。本アプリケーションノートで記載する以降の実験では、抗体濃度として 20 ng/測定を使用しました。

アッセイプロトコル

1. Step 1 BSA 標準曲線をポリプロピレン製チューブ内で作成します。BSA フリーアッセイバッファを用い、個包装の滅菌ピペットチップを使用して BSA 標準液（1 mg/mL ストック、Boehringer Mannheim 製）を段階希釈します。標準濃度は 10000〜125 pg/mL とし、推奨濃度は 10000、4000、2000、1000、500、250、125、0 pg/mL です。
   
   注意： 本アッセイでは無菌操作と個包装の滅菌ピペットチップの使用が必須です。その他のチップは高バックグラウンドの原因となります。手袋は不要です。
2. Step 2 サンプルは、個包装の滅菌ピペットチップとポリプロピレン製チューブを使用し、BSA フリーアッセイバッファで希釈します。
3. Step 3 ビオチン化抗体およびフルオレセイン化抗体を、それぞれ 20 ng/測定（200 ng/mL）となるよう BSA フリーアッセイバッファで調製し、1 本のポリプロピレン製チューブに混合します。
4. Step 4 BSA 標準液およびサンプルを 100 µL ずつ、個包装の滅菌ピペットチップを用いてポリプロピレン製チューブに分注します。
5. Step 5 Step 3 で調製した抗体混合液を 100 µL、Eppendorf Repeater Pipetter と Combitip® を用いて各チューブに分注します。
6. Step 6 チューブを Parafilm® で覆い、ラックを振って混合した後、室温で 2 時間インキュベートします。
7. Step 7 2 時間のインキュベーション中に、Enzyme Reagent を BSA フリーアッセイバッファ 4 mL で再構成します。インキュベーション終了後、Eppendorf Repeater Pipetter と滅菌済み Combitip を用いて各チューブに Enzyme Reagent を 100 µL 分注します。
8. Step 8 チューブを Parafilm で覆い、室温で 1 時間インキュベートします。
9. Step 9 1 時間のインキュベーション中に、Capture Reagent を BSA フリーアッセイバッファ 25 mL で再構成します。再構成した Capture Reagent を 1:10（Capture Reagent 1 容＋BSA フリーアッセイバッファ 9 容）で希釈します。インキュベーション終了後、Eppendorf Repeater Pipetter と滅菌済み Combitip を用いて各チューブに希釈した Capture Reagent を 1 mL 分注します。
10. Step 10 反応混合液をフィルトレーションユニットに移します。フィルターベースおよびフィルターブロックは、新品または再使用品のいずれでも使用できます（洗浄方法は ILA Detection Kit の添付文書を参照）。低真空でろ過します。
11. Step 11 ウェルが空になったら、Wash Buffer を 2 mL ずつ各ウェルに分注し、高真空でろ過します。
12. STEP 12 ウェルが空になったら真空を停止し、スティックを読み取ります。

アッセイの特性評価

標準曲線

標準曲線の最も低いキャリブレーターは、バックグラウンドシグナルに対して 30〜50 µV/sec のシグナル増加を生じる BSA 濃度を算出することで選定しました。この計算にはローディングスタディの結果を使用しました（詳細は Threshold System Operator’s Manual の ILA セクション「サンドイッチアッセイの最適化」を参照）。その他のキャリブレーターは、最も低いキャリブレーターより約 2 桁（100 倍）高い範囲に分布させました。画像 2 には、10000、4000、2000、1000、500、250、125、および 0 pg/mL の BSA 濃度を用いて作成した標準曲線を示します。得られた曲線は二次式で最も良好に近似されます。

インキュベーション時間

室温における最適なインキュベーション時間を決定するため、キネティックスタディを実施しました。BSA の 3 種類の濃度（1000、200、0 pg/mL）を、標識抗体とともに 1 時間、2 時間、4 時間、そして一晩インキュベートしました。標準曲線および各スティックのオンボードキャリブレーターについては、一晩インキュベートを行いました。続いて、Enzyme Reagent（ウレアーゼ結合体）を各チューブに分注し、すべてのチューブをさらに 1 時間インキュベートしました。

本キネティックスタディの結果を画像 3 に示します。標準液については、一晩インキュベーションによりシグナルが増加しましたが、他のインキュベーション時間と比較してバックグラウンド（0 pg/mL BSA）も増加しました。4 時間、2 時間、1 時間のインキュベーションでは、バックグラウンドは同一でした。しかし、インキュベーション時間の延長に伴いスロープの増加が認められました。最も高い感度は、BSA と抗体を 4 時間インキュベートすることで得られます。

本アプリケーションノートでは、BSA と抗体のインキュベーションを 2 時間とし、その後ウレアーゼ結合体を添加して 1 時間インキュベートする条件を採用しました。このプロトコルにより、感度と総アッセイ時間の両面で十分な性能が得られます。

検出限界

検出限界の評価については、Threshold System Operator’s Manual を参照してください。本 BSA アッセイでは、バックグラウンドから 4 標準偏差の分離をもって、125 pg/mL の BSA を検出することが可能です。

応用

本アッセイの性能評価は、ウシ胎児血清を含む細胞培養で産生された組換えタンパク質を用いて実施しました。各サンプルについて、非スパイク条件と 800 pg/mL の BSA を添加したスパイク条件の両方で試験を行い、スパイク回収率（SR）は以下の式により算出しました。

許容されるスパイク回収率は 100% ± 20% と定義されます。良好なスパイク回収が得られることは、サンプルが BSA の測定を妨害していないこと、そして BSA の定量が正確であることを示します。

本アッセイは、4 種類の組換え医薬品における BSA コンタミナントの測定に成功しました。対象は、マウス IgG1、マウス IgG2A、成長ホルモン、および治療用抗体です。

同一の実験において、治療用抗体の 4 つのロットを評価しました。サンプル濃度は 5.3〜6.5 mg/mL の範囲でした。得られた結果を表 3 に示します。

日間再現性を評価するため、Murine IgG1 サンプルを 6 日間にわたり 3 連測で試験しました。同一実験内の反復性は、6 反復の測定により評価しました。サンプルの最終濃度は 1.4 mg/mL でした。得られた結果を表 4 に示します。

考察

ILA Detection Kit の一部コンポーネントには BSA が含まれています。具体的には、Assay Buffer 濃縮液、Enzyme Reagent、Capture Reagent、およびスティック上のビオチン化メンブレンです。本アプリケーションノートで示したプロトコルに従えば、Enzyme Reagent、Capture Reagent、ビオチン化メンブレンに含まれる BSA はアッセイに干渉しません。
一方、逐次インキュベーションプロトコル（streptavidin–抗体–BSA 複合体がメンブレン上に捕捉された後に Enzyme Reagent を添加する方法）を用いると、非常に高く再現性のないバックグラウンドシグナルが生じます。
予備的な検討では、競合フォーマットを用いた BSA アッセイの開発も可能であることが示唆されています。

まとめ

本アプリケーションノートのデータは、3 時間のインキュベーションと、各標識抗 BSA 抗体 20 ng/テストを用いて取得しました。これらの条件により、約 2 桁（100 倍）のダイナミックレンジが得られ、BSA の検出限界は 125 pg/mL となります。アッセイは要求に応じて調整可能であり、迅速化のためにインキュベーション時間を短縮することも、より高感度化のために延長することもできます。アッセイ性能の妥当性は、試験する各製品ごとに評価する必要があります。