Application Note SpectraMax MiniMaxで
透過光を活用した高精度セルカウント法

はじめに

Caroline Cardonnel, PhD | Field Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Andrew Bashford, PhD | Field Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Simon Lydford | Field Applications Scientist Manager | モレキュラーデバイス

ヘマトキシリンは、ログウッド（Haematoxylin campechianum）の心材から抽出される天然色素で、組織学における染色プロトコールで最も一般的に使用される染料です。ヘマトキシリンは塩基性色素のように反応し、紫がかった青色を呈し、細胞核やRNAを含む細胞小器官（リボソームや粗面小胞体など）といった酸性または塩基好性構造を染色します *1 。

SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダーとSpectraMax® MiniMax™ 300 イメージングサイトメーターは、透過光（TL）、緑蛍光（Ex/Em: 460/541）、赤蛍光（625/713）のチャネルを搭載しています。MiniMaxサイトメーターはSoftMax® Proソフトウェアと組み合わせることで、さまざまな細胞をイメージングおよび解析できます。本稿では、ヘマトキシリンを用いて透過光イメージングのコントラストを高め、平坦な形態や細胞間スペースが識別しにくい細胞株におけるセルカウントを改善する方法を示します。

材料

• Mayer's Hematoxylin Solution（Sigma）
• CellStar 96 ウェル細胞培養プレート、μClear 底、黒色壁（Greiner）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• SpectraMax MiniMax® 300イメージングサイトメーター（モレキュラーデバイス）

方法

細胞培養

MDCK（Madin-Darby canine kidney）細胞（親株、MDCK I、MDCK II）は、European Collection of Authenticated Cell Cultures（ECACC）のDr. James Cooperより提供されました。細胞はEagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）+ 2 mMグルタミン + 1%非必須アミノ酸（NEAA）+ 10%ウシ胎児血清（FBS）で継代し、37°C、5% CO₂の加湿インキュベーターで維持しました。細胞は96ウェルプレートに1ウェルあたり4×10⁴細胞で播種し、実験前に37°Cで18～24時間培養しました。

ヘマトキシリン染色

細胞培養液を除去し、Mayer’s Hematoxylin Solutionをウェル表面を覆うように直接添加しました（96ウェルプレートの場合、1ウェルあたり50 µL）し、3～5分間作用させました。その後、溶液を除去し、成長培地で2～3回穏やかに洗浄してブルーイングを行いました。この工程により、核内のヘマトキシリンの初期の可溶性赤色が不溶性の青色に変換されます。

データ解析

透過光チャネルで取得した画像は、SoftMax Proソフトウェアの「Discrete Object Analysis」（セルカウント）機能を用いて解析しました。既定の解析設定「CellsB」または新規カスタム設定（「Create New Setting」）を使用し、個々の細胞を識別・カウントしました。SoftMax Proソフトウェアで画像ごとのオブジェクト数を算出しました。取得および解析設定は表1に示します。

表1. 未染色およびヘマトキシリン染色したMDCK細胞（全株）の取得・解析設定 ここで使用したプレートおよび細胞タイプの値を示します。他のプレートや細胞タイプでは異なる設定が必要な場合があります。

結果

MDCK細胞株は上皮様形態を持ち、タンパク質輸送、極性、膜透過性などのさまざまなメカニズムを研究するモデルとして広く使用されています。近年では、ウイルス感染やワクチン製造の研究にも利用されています *2。MDCK細胞の形態は株によって異なります *3。親株MDCK細胞はサイズが多様で不均一な形態を示します（図1A）。MDCK I細胞は非常に細かく、ほとんど識別できない細胞境界を持つ場合があります（図1B）。MDCK II細胞は多角形で、明確な細胞間境界を持ち、単層にモザイク状の外観を与えます（図1C）。

MDCK II細胞はSoftMax Proソフトウェアの既定解析設定「CellsB」で解析可能でした。しかし、他のMDCK細胞株では、形状やサイズの違い（MDCK）や細胞膜の視認性の欠如（MDCK I）により、ソフトウェアが適切にセグメンテーションできませんでした。

一方、ヘマトキシリン染色後は細胞内のコントラストが増し、暗く染まった核が明確に識別できるようになりました。ヘマトキシリン染色したMDCK細胞はMiniMaxサイトメーターの透過光チャネルでイメージングされ、その画像では核のコントラストが強調され、ソフトウェアによる識別が容易になりました（図2）。未染色細胞では識別できませんでした（図3）。この手法は、親株（図2）、MDCK I（図3）、MDCK II（図4）のすべての株で成功しました。

新しいデータ解析設定を開発し、すべてのヘマトキシリン染色MDCK細胞をカウントしました（表2）。この新しい方法の信頼性を確認するため、MDCK II細胞で既定設定「CellsB」を用いた透過光チャネルでのセルカウントと比較しました。セルカウントの差は約3%に過ぎず（表2）、ヘマトキシリン染色と新しいデータ解析を組み合わせることで、イメージングした細胞をより正確にカウントでき、細胞間境界が不明瞭な平坦な細胞のカウントに有効であることを確認しました。

表2. MDCK細胞のデータ解析（画像ごとのオブジェクト数を表示）

ヘマトキシリン染色は免疫蛍光法と両立できないことに注意してください。未知のメカニズムにより、すべての特異的染色が失われます *4。免疫蛍光データが必要な場合は、ヘマトキシリン染色の前に蛍光アッセイを実施してください。

結論

SoftMax Proソフトウェアによる統合データ解析機能を備えたMiniMaxサイトメーターを使用し、透過光チャネルでMDCK細胞株をイメージングおよび解析することに成功しました。ヘマトキシリン染色により透過光画像のコントラストが大幅に向上し、細胞間スペースが識別しにくい細胞でも正確にカウントできるようになりました。この手法は、平坦な細胞や細胞クラスターなど、カウントが難しい細胞株に対する有効なソリューションを提供します。蛍光染色のコストの一部で済むヘマトキシリンは、単純なセルカウントを目的とする場合、蛍光イメージングに代わる経済的な選択肢となります。

SpectraMax i3xリーダーとMiniMaxサイトメーターは、イメージングの利点とマルチモードマイクロプレートリーダーアッセイの多様性をシームレスに統合します。SoftMax Proソフトウェアは、データ収集から解析までのシンプルなワークフローを提供し、ユーザーがアップグレード可能なカートリッジオプションにより、あらゆるラボに合理的な追加機器となります。

参考文献

1. Titford M. The long history of hematoxylin. Biotech Histochem. 2005 Mar-Apr;80(2):73-8.
2. Lugovtsev VY, Melnyk D, Weir JP. Heterogeneity of the MDCK cell line and its applicability for influenza virus research. PLOS One. September 13, 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24058646/. org/10.1371/journal.pone.0075014.
3. Dukes JD, Paul Whitley P, Andrew D Chalmers AD. MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biology. 2011 12:43.
4. Fischer AH, Jacobson KA, Rose J, Zeller R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008 May 1;2008:pdb.prot4986.