Application Note SpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダーを用いた
ワイン中のL-リンゴ酸測定

  • 従来のシングルチューブアッセイに比べてスループットが向上
  • ワインサンプル中の分析物を直接定量
資料ダウンロード

PDF版（英語）

はじめに

リンゴ酸、残糖、揮発性酸度、アンモニアの分析は、ワイン生産中の品質管理にとって非常に重要である。マイクロプレートフォーマットで実施される酵素アッセイは定量的であり、時間と労力に関して高いスループットを達成するのに役立つ。これらのテストは、副産物としてNADHを与える分析物の酵素的変換を伴う。340nmの吸光度を測定してNADH生成を測定することで、ワインサンプル中の分析物を直接定量することができます。ここでは、Molecular Devices SpectraMax® Plus 384 マイクロプレートリーダーとSoftMax® Pro ソフトウェアを使用して、ワイン中の残糖の酵素的測定のデータを効率的に収集・分析する方法について説明します。

SpectraMax Plus 384 マイクロプレートリーダーのユニークな特徴は以下の通り：

  • 波長範囲 190-1000 nm、1 nm単位、フィルター不要
  • 読み取り速度：96ウェル：9秒
  • 384ウェル：29秒
  • 温度 周囲温度より4℃高い温度から45℃まで
  • キュベットポート 標準キュベットおよび12 x 75 mm試験管を収納可能
  • OD範囲 0-4 OD

酵素法によるワイン中のリンゴ酸定量（MAD）

酵素反応：

(1)L-(-)-リンゴ酸＋NAD＋オキサロ酢酸＋NADH＋H＋＋。

(2) オキサロ酢酸＋L-グルタミン酸L-アスパラギン酸＋a-ケトグルタル酸

LMDH：L-リンゴ酸脱水素酵素

GOT：グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ

反応ダイナミクス

平衡反応（上記の反応1）は、反応物（L-リンゴ酸とNAD+）の方向に有利である。この反応における反応物の生成は、生成物（L-アスパラギン酸とa-ケトグルタル酸）の生成を有利にする第二の反応とカップリングさせることによって阻止される。NADHの生成はL-リンゴ酸の酸化と化学量論的に関連しているので、L-リンゴ酸の測定は340 nmにおけるNADHの吸光度によって決定することができる。

パスチェック・センサー

パスチェックセンサーは、マイクロプレートウェル内のサンプルの光路長を測定する、Molecular Devices社の温度に依存しない機能です。マイクロプレートウェルの吸光度を1cmキュベットの吸光度に正規化する画期的な方法です。

図1. SpectraMax® Plus 384光学系。

Beer-Lambertの法則は、次のように定めています。

吸光度 = E * C * L

ここで
E = 吸光度（消衰係数）

C = 濃度

= 光路長

キュベットの場合、光路は水平なので、光路長は固定され、1cm に等しい。しかしマイクロプレートの場合、光路は垂直である。そのため、光路長はサンプルの体積に依存します（図2）。パスチェックセンサーはこの不一致を補正します。

図2. キュベットとマイクロプレートでは経路長が異なる。

ソフトマックス・プロ・ソフトウェア

ソフトウェアが装置を制御し、データを収集し、完全なデータ解析を行う。適切な装置設定と計算を含むカスタマイズされたプロトコルは、あらかじめ書いて保存することができます。エンドユーザーは、設定済みのプロトコルを開くだけで、プロトコルのセットアップ時間なしに、完全な結果と解析を得ることができます。

材料

  • SpectraMax Plus 384 マイクロプレートリーダー(Molecular Devices 社製 #PLUS 384)
  • 試薬添加用UV透明96ウェルマイクロプレート (Costar cat.# 3635)
  • トランスファーペットマイクロピペット（Drummond Scientific cat. #2704174、2705402、2705412、2704180; Drummond Digital Microdispenser cat.# 3-000-510)
  • マイクロピペット用マイクロチップ (Eppendorf 社のカタログ番号 #epT.I.P.S.; Reloads 社のカタログ番号 #022491539, 022491512, 022491547)
  • マイクロフュージチューブ用遠心分離機（エッペンドルフ社製 cat.）
  • 容量1.5 mLマイクロフュージチューブ（Eppendorf cat. #022364111, 022363557, 022363514, 2236357-3）
  • L-Malic Dehydrogenase 25 mg/5 mL (LMDH、Roche cat. #10127914001)
  • グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ 2 mg/mL (GOT, Roche cat. #10105546001)
  • ß-Nicotinamide-Adenine Dinucleotide (NAD, Roche cat. #10127990001)
  • グリシル-グリシン (Sigma cat. #G1002-100G)
  • L-グルタミン酸(Sigma cat. #G2128-500G)
  • 2.5NのKOH(フィッシャーサイエンティフィック社製 cat. #P251-500)

図3. ワイン中のリンゴ酸定量（MAD）

濃度 0.1 g/L 0.5 g/L 1.5 g/L
95 mL 95 mL 95 mL 95 mL
リンゴ酸 0.001 g 0.005 g 0.15 g

表1. L-リンゴ酸標準物質の調製。

方法

L-リンゴ酸標準試薬の調整

試薬は溶解するまで撹拌した。標準物質が決定係数(R)=1.000の標準曲線を示した場合、1.5mLの凍結チューブに入れ、-4℃で保存した。試薬が古すぎると理想的な標準曲線が得られないことがある。

緩衝液の調製

70mLの脱イオン（DI）H2Oに15.0gのグリシルグリシン、30.0gのL-グルタミン酸、67mLの2.5N KOHを加えた。2.5NのKOHでpHを10.0に調整した。この溶液の容量をメスフラスコで500mLに調整した。緩衝液は4℃で保存した。

ステップ1：ブランク、標準品、サンプルを二重測定した（表2）

試薬ブランク バッファー 300 µL 純水 5 µL
スタンダード バッファー 300 µL スタンダード 5 µL
サンプル バッファー 300 µL サンプル 5 µL

表2. ブランク、標準品、試料の調製。

ステップ2：L-リンゴ酸標準物質を冷凍庫から取り出し、室温まで温めた。

ステップ3：標準品とサンプルの分析に必要な量のバッファーを専用の「MAD」ビーカーに計量し、室温に温めた。このステップは、理想的な決定係数を得るために必要である。

ステップ4：表3に従って、GOTとNADを緩衝液に加えた。GOTとNADは、酵素を変性させないよう、十分に、しかし穏やかにバッファーに混合した。

バッファー必要量 GOT添加量 NAD添加量
105 µL 10 µL 0.024 g
50 mL 35 µL 0.12 g
100 mL 70 µL

0.24 g
150 mL 105 µL 0.36 g
200 mL 140 µL 0.48 g
250 mL 175 µL 0.60 g

表3. 反応バッファーに加える必要のあるGOTとNADの計算。

ステップ5：300μLマルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに300μLの緩衝液を分注した。

ステップ6：5µLのDI H2O、標準品、またはサンプルを適切なウェルに分注しました。

ステップ7：試薬を上下にピペッティングして混合しました（トリチュレーション）。

ステップ8：プレートを30秒間ボルテックスして混合し、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。

ステップ 9: 最初の読み取り値の直後に、1-20 µL マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに LMDH を 5 µL ずつ分注した。

ステップ 10： プレートを30秒間ボルテックスして混合し、室温で21分間インキュベートした。

ステップ 11：21 分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーで、同じ装置設定で「最終」読み取りを行った。

機器のセットアップ

装置はSoftMax Proソフトウェアでプログラムした。設定はソフトウェアのプレートセクションで選択した（図4）

図4. MADアッセイの装置設定。A：全体的な設定 B：PathCheckの設定。

読み取りタイプはエンドポイント。

波長ウィンドウに適切な数値を入力し、波長を340nmに設定した。

"PathCheck "オプションで水定数を選択した。反応は水環境で行われたため、装置のファームウェアに含まれる水定数が使用された。

混合はプレートシェーカー上で外部的に行われたため、自動混合は選択されませんでした。自動校正では、装置は選択された波長に対して自ら校正を行った。

図5. MADアッセイ用のテンプレートのセットアップ。最初のプレートにはテンプレートをセットアップしなかった。最終プレートのブランクには、標準品と未知検体を割り当てた。

適切なプレートフォーマットと読み取り対象のウェルが選択された。

同じプレートセクションを2つ作成した。最初のプレートセクションは、すべての試薬を含むが酵素を含まないプレートの読み取りを行った。最後のプレートセクションは、酵素を用いた実際の反応である。初期プレートセクションの光学密度測定値は、還元設定により最終プレートセクションの光学密度測定値から差し引かれた（図6）

図6. MADアッセイ用の減算セットアップ。最終プレートの同じウェルの光学濃度から初期プレートの各ウェルの光学濃度を差し引くために使用されるカスタム式を示すリダクションセットアップ。計算にはPathCheck値が適用された。

結果

実験は「材料と方法」のセクションに記載したように行った。酵素を除く反応混合物を含むプレートでベースラインの読み取りを行った（図7、パネルA）。反応混合物に酵素を加えた後、プレートを室温で21分間インキュベートし、最終的な読み取りを行った（図7、パネルB）

図7. MADアッセイの結果。すべての試薬を添加し、酵素を添加しない状態で読み取ったプレート（A）と、酵素を添加してインキュベートした後に読み取ったプレート（B）

SoftMax Proソフトウェアは、標準物質の平均、標準偏差、%CVを自動的に計算し、グループセクションに集計した（図8）

図8. 平均、標準偏差、%CVの計算を伴う標準群セクションの計算。

標準曲線

標準曲線は、グループセクション "Std "の情報を用い、X軸に濃度、Y軸に反復試料の平均OD値をとって作成した。標準偏差はエラーバーに使用され、プロットには線形曲線フィットが割り当てられた。この標準曲線は、"Unknown "と表示されたワインサンプル中のL-リンゴ酸濃度の測定に使用された（図9）

図9. MAD測定標準曲線。標準曲線は一次曲線フィットでプロットされ、ワインサンプル中のリンゴ酸濃度を導き出すために使用された。

ワイン試料中のL-リンゴ酸濃度の測定

テンプレートセクションのワインサンプルのウェルの割り当てに従って、"Unknown "と指定されたグループセクションが形成された（図10）

図10. ワインサンプル中のリンゴ酸濃度の計算。ワイン試料中のリンゴ酸濃度は標準曲線を用いて算出した。

各サンプル中のリンゴ酸は、標準曲線を用いてソフトウェアにより算出された（図11）

図11. 標準曲線を補間するためのカスタム式。Unknown "グループ・テーブルの "Result "列の計算式で、標準曲線からの補間によりワイン・サンプル中のリンゴ酸を自動計算。

結論

Molecular Devices SpectraMax Plus 384 マイクロプレートリーダーは、ワイン中のL-リンゴ酸の酵素定量測定に最適です。

コストと時間の効率に優れています。

SpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダーのチューナビリティとPathCheckセンサー機能は、より高い精度と正確性を達成するのに役立ちます。

SoftMax Proソフトウェアは、複雑で大規模なデータセットの分析と計算に便利なツールです。あらかじめ書き込まれたすぐに使用できるプロトコール、カスタム式、適切なグラフ作成オプションが用意されています。

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Readerなど、吸光度検出モードを備えた他のMolecular Devices製リーダーも、このアプリケーションに使用できます。

スループットの向上が必要な場合は、Molecular Devices StakMax® マイクロプレート処理システムをSpectraMax リーダーと統合し、20、40、または50マイクロプレートのバッチ処理を自動化することができます。

SpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダーについてさらに詳しく >>

資料ダウンロード

PDF版（英語）