Application Note SpectraMax ABS/ABS Plusマイクロプレートリーダーでの少量、
ハイスループットのDNAおよびタンパク質検出
- 190-1000 nmの波長域で定量実験の幅を広げる。
- SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートにより、感度を維持しながらサンプル量を最小限に抑えることができます。
- SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルで実験を簡素化、迅速化
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はじめに
ホアン・ハー｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
核酸やタンパク質の定量法は、遺伝学や分子生物学における多くの高度なアッセイの上流で不可欠な測定法である。これらの生物製剤を定量するために様々な方法が開発されているが、最も一般的に用いられているのは、やはり紫外線（UV）分光光度法である。分光光度法の基本は、すべての分子がある波長範囲の光を吸収または透過することであり、試料のモル吸光係数と測定光路長を事前に知っていれば、ランベルト・ベールの法則（式1）を用いて濃度を計算することができる。
A = εcL
式1：ランベルト・ベールの法則によれば、吸光度（A）は測定分子のモル係数（ε）に濃度（c）と光路長（L）を掛けたものに等しい。この式を並べ替えると、吸光度を使って濃度を計算することができる。
核酸の定量法は非常によく確立された技術であり、その基本原理は当初からあまり変更されていない。核酸濃度を計算するために、サンプルは260nmで測定され、サンプルの純度をチェックするために230nmと280nmの波長で補助的な測定が行われる。
タンパク質サンプルはUV分光光度法でも定量できるが、より正確な比色分析法がある。UV分光光度法では、トリプトファンの芳香族特性を利用して280nmの光を吸収するが、アミノ酸配列中のトリプトファン残基の量が異なるため、タンパク質濃度の計算が歪む可能性がある。別の方法として、Bicinchoninic Acid（BCA）タンパク質アッセイは、アミノ酸配列や長さに依存せずにタンパク質濃度を測定することができる。このアッセイでは、銅ベースのビウレット反応を利用し、アミノ酸骨格がアルカリ性環境下で銅分子とカラーキレート錯体を形成します。
SpectraMax® ABS Plusは、この種の定量アッセイに最適なコンパクトなUV-Vis吸光度マイクロプレートリーダーです。ここでは、ABS PlusリーダーとSpectraDrop™Micro-VolumeマイクロプレートおよびSoftMax® Proソフトウェアを組み合わせて、二本鎖DNAおよびウシ血清アルブミン（BSA）タンパク質を定量する方法をいくつか紹介します。
材料
- SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製 cat.）
- SpectraDrop™マイクロボリュームマイクロプレート（Molecular Devices社製 cat.）
- 96ウェル、透明、平底ポリスチレンマイクロプレート（Greiner Bio-One cat.）
- UltraPure™ Calf Thymus DNA Solution（ThermoFisher Scientific 社のカタログ番号 #15633019）
- Pierce BCAタンパク質アッセイキット（ThermoFisher Scientific社製 cat.）
- Pierce ™ ウシ血清アルブミン標準アンプル、2 mg/mL（ThermoFisher Scientific 社、商品番号 23209）
- UV-Star ® 96ウェルマイクロプレート（Greiner Bio-One cat.）
方法
DNA定量
1000ng/µLから始まるdsDNAの2倍希釈系列を、1xPBSで希釈したUltraPure子牛胸腺DNAから調製した。サンプル2 µLまたは4 µLを64ウェルのSpectraDropマイクロプレートにピペッティングし、0.5 mmまたは1.0 mmのカバースリップでdsDNAサンプルを覆った。SoftMax Proソフトウェアで設定済みのプロトコル「SpectraDrop DNA Quantitation」を開き、提供された設定を使用してプレートを読み取った。データにlog-logカーブフィット処理を適用し、SoftMax Proソフトウェアを使用して標準曲線を作成した。さらに、サンプルの純度を評価するために、220 nmから350 nmまで、4 nmステップのスペクトルスキャンをすべての濃度で行った。
キュベットまたはマイクロプレートフォーマットでのDNA定量も比較した。250ng/µLから0.5ng/µLまでの2倍希釈系列を、UV透過96ウェルマイクロプレートにウェル当たり200µLの容量で、または複数のUV-Visキュベットに1000µLの容量で移した。SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーを用い、波長260 nmで読み取った。各データセットにlog-logカーブフィット処理を行い、SoftMax Proソフトウェアを用いて標準曲線を作成した。
タンパク質の定量
BCAアッセイ標準曲線は、アッセイキットのプロトコールに従って提供されたBSAを希釈して調製した。25μLのタンパク質標準物質と200μLのBCA作業試薬を96ウェルの透明マイクロプレートに移し、37℃で30分間インキュベートした。SoftMax Proソフトウェアで "BCA "事前設定プロトコルを開き、提供された設定を使用してプレートを562 nmで読み取った。データに2次曲線フィット処理を適用し、SoftMax Proソフトウェアを用いて標準曲線を作成した。
結果
ABS Plusマイクロプレートリーダーは、少量法と標準マイクロプレート法の両方を用いてdsDNA濃度を定量することができた。SpectraDropプレートと事前に設定したプロトコルを使用することで、ABS Plusマイクロプレートリーダーは、わずか4μLのサンプルで2ng/μLまで検出でき、A260/A280比やA260/A230比などの関連パラメーターを自動的に測定・計算することができた（図1および図2）。スペクトルスキャンにより、サンプルに汚染がないことがさらに証明された（図3）。
ABS Plusマイクロプレートリーダーは、少量法と標準マイクロプレート法の両方を用いてdsDNA濃度を定量することができた。SpectraDropプレートと事前に設定したプロトコルを使用することで、ABS Plusマイクロプレートリーダーは、わずか4μLのサンプルで2ng/μLまで検出でき、A260/A280比やA260/A230比などの関連パラメーターを自動的に測定・計算することができた（図1および図2）。スペクトルスキャンにより、サンプルに汚染がないことがさらに証明された（図3）。
図2. SoftMax Proソフトウェアの設定済みデータテーブル。ソフトウェアの設定済みプロトコールは、未知サンプルの吸光度比と濃度を自動的に計算し、DNA定量実験を簡素化します。
図3. SoftMax Proソフトウェアの設定済みデータテーブル。サンプルの純度を評価するためにスペクトルスキャンを行った。4つの代表的な濃度のDNAがスキャンされ、純粋なdsDNAを示す260 nmのピークのみが確認された。
あるいは、ABS Plusマイクロプレートリーダーは、マイクロプレート形式でdsDNAを定量することができる。UV透過マイクロプレートを用いれば、0.5 ng/μL dsDNAの測定も可能である（図4）。
図4. 96ウェルマイクロプレートまたはキュベットでのdsDNA定量。dsDNA希釈系列は、キュベットとマイクロプレートの両方のフォーマットで、250ng/μLから0.50ng/μLまで検出可能であった。さらに、どちらの希釈系列も高い直線性を示した。
最後に、SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーを使用して、BCAアッセイを利用し てタンパク質サンプルを定量することができる。提供されたプロトコールに従ってBSA標準物質を測定し、アッセイキットの文献にある曲線と同等の標準曲線を作成した（図5）。
図5. BCAアッセイ標準曲線。ABS Plus マイクロプレートリーダーは、BCA アッセイから得られた BSA 標準物質を検出できた。SoftMax Pro ソフトウェアを使用してデータポイントに二次曲線フィットを適用し、ロバストな標準曲線（r2 = 1.000）を作成した。
結論
SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダーは、キュベットやマイクロプレートのような様々なフォーマットの核酸およびタンパク質サンプルを定量できる、コンパクトで適応性の高いマイクロプレートリーダーである。SpectraDropマイクロボリュームマイクロプレートと組み合わせると、1回の読み取りで、わずか2µLのサンプル量で最大64サンプルを定量できる。さらに、SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルは、実験の最適化と結果までの時間の短縮を可能にする。
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