Application Note タイムラプスライブセルイメージングを用いた
シンプルなスクラッチアッセイによる細胞移動の測定

はじめに

Jayne Hesley｜イメージングアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

細胞移動は、血管新生、胚発生、癌転移、免疫応答、創傷治癒の生理学的メカニズムを解明するために長い間研究されてきました。本アプリケーションでは、ライブセル単層に人工的に作製した「創傷」の閉鎖過程を測定するための、シンプルかつミディアム〜ハイスループット対応の創傷治癒アッセイをご紹介します。このアッセイを96ウェルマイクロプレートで実施することにより、1回の管理された実験において、適切な複製を持つ複数の化合物を試験することができます。このアッセイでは、細胞の増殖、移動、拡散のすべてが、細胞が傷を閉じる能力に寄与しました。透過光または生細胞対応蛍光を用いた自動化タイムラプスイメージングにより、「治癒」の進行を測定する手段が提供されました。各時点の画像はハイコンテント画像解析ソフトウエアで対物レンズ解析が可能で、データを時系列としてプロットしたり、特異性のある時点で個別に評価することができます。

方法

以下の実験では、細胞を96ウェルポリスチレンイメージングプレートに、インキュベーターで一晩培養後コンフルエンスに達するように最適化した濃度でプレーティングしました。細胞密度40,000個/ウェルで2つの細胞株を用いた：HT1080ヒト線維肉腫とU2OSヒト骨肉腫。細胞を一晩接着させた後、20µLの使い捨てピペットチップ12本を手動マルチチャンネルピペッターにセットし、ウェルの各列を上から下へしっかりとドラッグして、同時に各単層の表面に薄い傷をつけました。プレートを光学顕微鏡で検査し、均一なスクラッチを確認した後、培地を吸引し、培地で調製した200μLの化合物を添加する前に、200μLの温DPBSでウェルを1回洗浄しました。HT1080細胞株は、化合物処理時に100 nM siRactin（Spirochrome）を添加して標識しました。U2OS細胞株は、すでにRFP-アクチンを発現するように安定的にトランスフェクトされていました。マイクロプレートは、環境制御と透過光オプションを備えたImageXpress Micro 4システムにセットしました。 プレートは4倍の対物レンズを用い、透過光、RFP、siR-actin適合性の蛍光波長で1視野/ウェルを20時間毎、さらに22時間毎に自動的にイメージングしました。タイムラプスイメージング後、プレートを4％ホルムアルデヒドで固定しました。別のプロトコールとして、マイクロプレートを撮像し、次の時点までインキュベーターに戻し、再度撮像して前の読み取りに追加することで、「不連続」タイムラプスを構築することもできます。

タイムラプス画像は、あらかじめ設定された透過光セグメンテーションアルゴリズムを使用するカスタムモジュール、または細胞のアクチン染色に蛍光イメージセグメンテーションを使用するモジュールを使用して、MetaXpress®ソフトウェアで解析しました。

透過光を用いてスクラッチ部の開放面積を測定

対物レンズが4倍あれば、96ウェルプレートの中心近くに注意深く傷をつけて、1視野でウェルの広い範囲を画像化できます（図1）。最も時間を節約するために、プレート内のすべてのウェルを事前に素早く読み取り、タイムラプス実験中に、通過可能な傷を含むウェルだけを画像化することができます。

図1.スクラッチ後のタイムゼロにおいて、プレート全体のサムネイルモンタージュを確認することで、各ウェル間の傷害処理の効率と均一性を評価できます。緑で囲まれたウェルはスクラッチが不完全または未実施であり、解析から除外されました。

透過光画像はMetaXpress®ソフトウェアでのセグメンテーションに適しており、単純な透過光モジュールを使用して細胞を同定し、細胞で覆われたウェルの面積を計算するか、コントラストが低い画像や多数のアーチファクトがある画像の場合は、カスタムモジュールエディターツールボックスから画像処理とフィルタリングのステップを追加して、開創面積の正確な測定を可能にします（図2）。 各細胞タイプについて蛍光画像も取得し、これらの実験での透過光画像を用いた解析結果は満足のいくものでしたが、蛍光データは示していません。

図2. A. 上段の画像は、接着性U2OS細胞を透過光およびTRITCチャネル（Actin-RFP）で取得し、4倍対物レンズを用いて撮影したもので、コルヒチン（100 nM）処理後の代表的な3つのタイムポイント（1時間、11時間、23時間）を示しています。 B. 中段のパネルは、MetaXpressソフトウェアの「Transmitted Light (Cell B) Segmentation」モジュールを用いて生成されたマスクを示しています。黄色で示された領域が細胞として認識され、その総面積が定量されます。 C. 下段のパネルは、細胞が存在しない領域を特定するためにカスタムモジュールで生成された水色のマスクを示しています。計算された結果はマスク画像上に重ねて表示されており、時間の経過に伴うスクラッチ領域の縮小が視覚化されています。

各治療の平均データを時間に対してplotすることで、スクラッチ領域への細胞移動の進行を示すことができます（図3と4）。どのウェルも、単一波長または取得した波長のオーバーレイを使用して、簡単にムービーに変換することもできます。

図3.スクラッチ領域に移動するコントロールと処理したU2OS細胞の進行を20時間にわたってプロットしたデータ。左のグラフは、透過光画像から求めた、細胞で覆われたウェルの総面積を単純に計算した結果です。細胞の総面積は、細胞移動に対する化合物処理の効果に応じて、様々な速度で経時的に増加します。右のグラフは、創傷面積の減少によって測定された創傷の閉鎖を示します。 このグラフは、図2で見た画像セグメンテーション画像と相関しています。両方の解析から、コルヒチンは細胞の移動を有意に阻害すると結論づけることができます。

図4. スクラッチに移動するコントロールと処理したHT1080細胞の進行を示すために、20時間にわたってplotしたデータ。左のグラフは、透過光イメージングから求めた、細胞で覆われたウェルの総面積を単純計算した結果であす。 細胞総面積は、細胞移動に対する化合物処理の効果に応じて、様々な速度で経時的に増加します。右のグラフは、創傷面積の減少によって測定された創傷の閉鎖を示す。両方の解析から、コルヒチンは細胞の移動を有意に阻害すると結論できます。

異なる細胞種を用いても有効な結果が得られます

Transmitted Light Analysis Module for Cell Type B（より大きな細胞用に最適化されている）を使用することで、HT1080とU2OSの両方の細胞の結果が生成されました。 両方の細胞タイプのタイムラプスデータは、画像の目視評価と相関していました。

主要なタイムポイントのみを取得することで、時間とストレージ容量を節約可能

マルチユーザー環境では、長時間のタイムラプス実験が装置を独占し、他の研究者のアッセイを妨げる可能性があります。MetaXpressソフトウェア バージョン6.5の不連続タイムラプス機能を使えば、生細胞のプレートをインキュベーターから取り出し、必要なときに画像取得し、個々の取得を1つの実験に追加してシームレスなタイムラプス解析を行うことができます（図5）。これによって、細胞がスクラッチに完全に移動するのに何日もかかるような場合に、余計なデータが多く生成されることもなくなります。また、マルチウェルマイクロプレートでタイムラプスアッセイを実行する場合、データベースの容量を節約することができます。

図5. 不連続タイムラプス取得はバーコードを入力することで行います。有効化すると、すべてのタイムポイントがバーコードを封じ込めた同じファイルに追加され、標準的なタイムラプス実験として収集されたかのようにまとめて解析することができます。

96ウェルにわたる20以上のタイムポイントの解析を完了するにはかなりの時間がかかりますが、複数のコンピュータコアの並列処理を利用するMetaXpress PowerCoreで解析を実行することにより、解析は最大10倍速く完了します。

結論

ImageXpress Microシステムにより、研究者はコンフルエントな細胞単層に "wounding"（傷をつけること）してできた無細胞領域への細胞の移動を経時的に定量することができます。タイムラプス画像は、決められた間隔で自動的に取得することも、プレートを装置から出し入れして手動で取得することもできます。例えば、装置が生細胞イメージングを維持するために必要な環境制御オプションを備えていない場合や、長時間のタイムラプス実験中に他のユーザーも同じ装置で画像を取得する必要がある場合などです。装置は、低密度（12-48ウェル）組織培養プレートまたは96ウェルマイクロプレートで、2X-10Xの低倍率対物レンズを使用して行うスクラッチアッセイに対応し、複数の視野が必要な場合は、ソフトウェアでサイトをつなぎ合わせることができます。統合されたMetaXpress®画像解析ソフトウェアは、透過光または蛍光イメージの解析を提供し、細胞で覆われた単純な面積から、傷の幅や傷の面積のようなより複雑な測定値までのデータを生成します。

図6. 6つのタイムポイントを様々な間隔で取得し、A) 開いた傷の面積、B) 細胞で覆われたウェルの面積を分析。どちらの解析も透過光画像を用いて行いました。どちらの場合も、コルヒチンが傷口への細胞の移動を遅らせたことは明らかです。