Application Note NanoBRET技術による
p53-MDM2タンパク質間相互作用の測定

はじめに

ジョイス・イタタニ｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
キャシー・オルセン博士｜シニア・アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

BRET (bioluminescence resonance energy transfer)は、生体発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用によって、タンパク質間またはタンパク質とリガンドの相互作用を測定する技術である。ドナーとアクセプターが10nm以上近づくと、ドナーがアクセプターを励起し、蛍光を発する。目的のタンパク質をドナーで、その結合パートナーをアクセプターでタグ付けし、マイクロプレートリーダーを用いてドナーとアクセプターが発する光を検出することで、タンパク質間相互作用を測定することができる。

プロメガ社の NanoBRET™ 技術は、BRET1 や BRET2 を含む前世代の BRET を改良し、より明るい発光ドナー（NanoLuc ルシフェラーゼ）、最適化されたエネルギーアクセプター（HaloTag®-NCT）、ドナー・アクセプター間のより広い波長分離を組み込んでいます（図 1）。これらの改良により、シグナルが増加し、感度が向上し、SB比が低下し、生きた細胞内でのタンパク質間相互作用の検出が可能になりました1。

NanoBRETシグナルを検出し、得られたデータを解析するには、高感度のインストゥルメンテーションと高度なソフトウェアが必要です。SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーと SoftMax® Pro ソフトウェアを用いれば、最適化されたフィルターセットを用いて NanoBRET データを取得し、カーブフィット処理などの解析を行うことができます。ここでは、SpectraMax iD5リーダーで、相互作用タンパク質パートナーp53とMDM2からなるNanoBRET™ PPI Control Pairを用いたマイクロプレートリーダーの検証について説明します。p53経路活性化剤nutlin-3を用いて濃度依存的にp53-MDM2相互作用を破壊し、結果をSoftMax Proソフトウェアを用いて解析しグラフ化した。

材料

• NanoBRET PPI コントロールペア (p53, MDM2; Promega cat. #N1641)
• NanoBRET Nano-Glo ® 検出システム (プロメガ社: #N1661)
• ViaFect™ トランスフェクション試薬 (Promega cat. #E4981)
• Nutlin-3（ミリポア-シグマ社、商品番号6287）
• Opti-MEM™ 還元血清培地、フェノールレッド不使用 （ThermoFisher cat.）
• 293(HEK-293)セル (ATCC cat. #CRL-1573)
• イーグル最小必須培地（EMEM、Corning cat.）
• BenchMark™ ウシ胎児血清（Gemini Bio-Products cat.）
• ペニシリン-ストレプトマイシン（10,000 U/mL、ThermoFisher cat.）
• 6ウェルクリアマイクロプレート（VWR cat.）
• 96ウェル白色平底ポリスチレン・マイクロプレート（Corning cat.）
• SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices cat：
  ⚪︎ドナーフィルター： ドナーフィルター：447 nm BW 60 nm（Molecular Devices社カタログ番号6590-0088）
  ⚪︎アクセプターフィルター：610 nm LP（Molecular Devices社カタログ番号6590-0117）

方法

HEK-293細胞を細胞培養培地（EMEM＋10％ウシ胎児血清＋1％ペニシリン／ストレプトマイシン）に40万個／mL懸濁し、6ウェルプレートに2mL／ウェル、または80万個／ウェルでプレーティングした。細胞を37℃、5% CO2で4～6時間ウェルに接着させた。その後、2μg p53-HaloTag Fusion Vector DNAと0.2μg NanoLuc-MDM2 Fusion Vector DNAを、フェノールレッドを含まない100μL Opti-MEM 還元血清培地中、ViaFectトランスフェクション試薬:DNA比3:1でトランスフェクトした。セルを37℃、5% CO2で一晩、20～24時間インキュベートした。

HEK-293細胞を1,000rpmで5分間回転させて回収し、培地を廃棄した。セル密度をOpti-MEM+4%FBSで2.2 x 105 cells/mLに調整し、15mLコニカルチューブ2本に分けた。一方のチューブは0.1μM HaloTag 618リガンドで処理し、もう一方はリガンドなしで処理した。細胞を96ウェルの白色マイクロプレートに1ウェルあたり2 x 104細胞でプレーティングし、直ちにnutlin-3の1:3連続希釈液（n = 4 replicates per concentration）または0.5% DMSOで処理した。細胞を37℃、5% CO2で一晩インキュベートした。

NanoBRET Nano-Glo基質の5X溶液をOpti-MEM+4% FBSで調製し、各ウェルに25μLずつ添加した。ドナーの発光（447 nm）とアクセプターの発光（610 nm）をSpectraMax iD5リーダーで表1に示す設定で測定した。NanoBRET 比は SoftMax Pro ソフトウェアでアクセプターシグナルをドナーシグナルで割って算出し、比を 1000 倍してミリBRET 単位（mBU）とした。mBU 値は、リガンドを封じ込めなかったサンプルの平均 mBU を差し引くことでバックグラウンド補正した。Nutlin-3処理細胞の結果は、SoftMax Proソフトウェア（バージョン7.0.3以降）の4パラメータカーブフィットを用いて解析し、グラフ化した。アッセイ性能を評価するため、nutlin-3 の各濃度において Z'因子を算出した。

*リードハイトは使用するマイクロプレートに最適化する必要がある。表 1. SpectraMax iD5 リーダーの NanoBRET 検出設定。

結果

NanoBRET 比率（mBU）対 nutlin-3 濃度を SoftMax Pro ソフトウェアの 4パラメータカーブフィットを用いてグラフ化した（図 2）。算出された nutlin-3 の IC50 値は 1.2 μM で、プロメガ社の NanoBRET PPI Control Pair2 の結果と一致した。

図 2 に示す曲線を作成するために用いた nutlin-3 のすべての濃度で、少なくとも 0.7 の Z'因子が得られた。0.07 μM 以下の濃度では、Z' factor は 0.9 に等しかった。これらの値はこの NanoBRET アッセイのロバスト性と変動性の低さを示している。

結論

NanoBRET ドナーとアクセプターシグナルの検出に最適なフィルターを装備した SpectraMax iD5 リーダーを用い、NanoBRET PPI Control Pair (p53, MDM2)を用いてこのアッセイを検証した。Nutlin-3は濃度依存的にp53-MDM2相互作用を阻害し、IC50値は1.2μMと予想された。SpectraMax iD5 リーダーの感度と NanoBRET アッセイのロスト性が確認された。SoftMax Pro ソフトウェアは NanoBRET 比率を計算し、データを自動的にグラフ化するように設定され、分析を効率化しました。

参考文献

1. NanoBRET-タンパク質-タンパク質相互作用解析のための新しいBRETプラットフォーム。NanoBRET-A Novel BRET Platform for the Analysis of Protein-Protein Interactions. ACS Chem. Biol. 2015, 10, 1797-1804.
2. 技術マニュアル： NanoBRET Protein： タンパク質間相互作用システム. Promega Corporation.