Application Note FLIPR膜電位測定キットを用いた
FLIPRシステムによる膜電位測定

セクション I：はじめに

イオンチャネルは、製薬業界において重要な創薬ターゲットです。従来、膜電位の変化を測定する方法として「ゴールドスタンダード」とされるパッチクランプ法が用いられてきました。この方法は非常に有用ですが、作業負荷が高く、時間もかかるため、イオンチャネルを対象としたハイスループットスクリーニングには適していません。

モレキュラーデバイスは、膜電位の変化を迅速かつ簡便に、そして信頼性高く検出する蛍光アッセイとして「FLIPR膜電位測定キット」を開発しました。このアッセイは、パッチクランプ法に匹敵する情報量を提供し、FLIPRシステムと組み合わせることで、イオンチャネル創薬ターゲットのハイスループットスクリーニングに非常に適したシステムとなります。

このアッセイでは、まず細胞を培養液とともにマイクロプレートに播種します。次に、染料を細胞に添加し、染料が細胞膜を通じて均衡化します。その後、細胞を含むマイクロプレートをFLIPR装置に移し、化合物やコントロールを細胞に添加しながら蛍光シグナルをモニタリングします。

本テクニカルノートでは、FLIPRシステムと膜電位測定キットを用いた膜電位アッセイの基本的なプロトコールを紹介するとともに、アッセイの最適化やトラブルシューティングに関する重要なパラメーターについても解説します。なお、細胞株ごとに特性が異なるため、プロトコールは各アッセイに応じて最適化する必要があります。

「原理」セクションでは、各ステップの目的を説明しています。「材料と方法」セクションでは、使用する材料と手法を詳述しています。「トラブルシューティングガイド」では、よくある問題への対処法を紹介しています。さらに、「付録A」では、膜電位アッセイに使用する消耗品の一覧を掲載しています。

セクション II：膜電位アッセイの原理

パッチクランプ法との比較

FLIPR膜電位測定キットは、パッチクランプ法に匹敵する高情報量のデータと、FLIPRシステムによるハイスループットスクリーニングの利点を兼ね備えています。パッチクランプ法の最大の利点は、非常に高速な応答時間で、単一細胞レベルでの膜電位の急速な変化を検出できる点です。従来、FLIPRでイオンチャネルを研究する際にはDiBACなどの染料が使用されてきましたが、これらは応答時間が長いという課題がありました。新しい膜電位測定キットでは応答時間が短縮され、DiBACでは10～30分かかっていたアッセイが、1～2分で完了できるようになりました。さらに、パッチクランプ法とのデータ比較では良好な相関が得られており（図1および図2参照）、チャネルの開閉の両方を観察することが可能です。これは、膜電位の一方向の変化しか示せないことが多いDiBACとは異なります（図3参照）。

本キットでは洗浄ステップが不要であり、染料はDiBACに比べて温度変化に対する感度が低いため、プレートを事前にセットアップしてバッチ処理することが可能です。これらの特長により、本アッセイは自動化に非常に適しています。

さまざまな細胞種の使用

FLIPR膜電位測定キットは、接着性細胞および非接着性細胞の両方を含む多くの細胞種に対応するよう設計されています。研究室での標準操作手順に基づき、ユーザーの裁量でさまざまな細胞の取り扱い条件が採用されることを想定しています。FLIPR膜電位測定キットの最適な細胞条件としては、FLIPRで測定を行う前にコンフルエントな細胞単層を形成することが推奨されます。

細胞は、透明で平底の黒色または透明壁の96ウェルまたは384ウェルの組織培養プレートに播種します。平底であることで、細胞の蛍光が水平面に集約されます。接着性細胞は実験の前日に播種し、非接着性細胞は実験当日に播種します。すべてのステップは同じプレート内で行われます。基本的なアッセイ手順は以下の通りです：

• 細胞をプレートに播種します
• 細胞に染料をロードします
• FLIPRシステムでアッセイを実施します

アッセイ当日に均一で80～90%のコンフルエントな単層が形成されるよう、細胞播種密度を最適化する必要があります。過度にコンフルエントな状態では、化合物への細胞応答が低下する可能性があります。通常、サブコンフルエントで維持されている細胞は、比較的低密度で播種する必要があります。細胞株によっては、ポリ-D-リジンなどでコーティングされた接着マトリックス付きプレートを使用することで、接着性を高め、化合物添加時の細胞の「吹き飛び」を最小限に抑えることができます。

細胞への染料のロード

染料ロードのプロトコールは、最良の性能を得るために細胞株ごとに最適化する必要があります。

蛍光染料

FLIPR膜電位測定キットの内容物は、FLIPRシステムのプロトコールに従って使用することで、堅牢な結果が得られるよう最適化されています。本キットに含まれる染料は、脂溶性の陰イオン性ビスオキソノール染料であり、生細胞の細胞膜を通じて膜電位に依存して分配されます。染料が細胞質タンパク質に結合すると蛍光強度が増加します。細胞が脱分極すると、より多くの染料が細胞内に取り込まれ、細胞内の脂質やタンパク質への結合が増加することで蛍光シグナルが増加します。逆に、細胞が過分極すると染料が細胞外へ排出され、細胞内濃度が低下することで蛍光シグナルが減少します。染料はアルゴンイオンレーザーの488 nm波長で励起されます。

キットの組成は企業秘密であり、特許出願中です。

ロード時間と温度

最適な染料ロード時間は細胞種によって異なります。蛍光染料は一般的に細胞に対して毒性があるため、最適時間を超えないようにすることが重要です。ほとんどの細胞株では、37℃で60分間のロードが有効であり、アッセイ開発の出発点として推奨されます。

ノート： 一部の細胞株では、30分間のロードでも十分な蛍光シグナルと安定したベースラインが得られることが確認されており、その場合は短い時間を使用してください。また、場合によっては室温でのインキュベーションの方が37℃よりも効果的なこともあります。

化合物プレートの準備

化合物プレートの準備には、内容の複雑さに応じて時間がかかる場合があります。そのため、細胞が準備できた時点で化合物プレートも使用可能な状態にしておくよう、実験計画を慎重に立てることが重要です。つまり、細胞プレートにLoading Bufferを添加する前に、化合物プレートを準備しておく必要があります。

化合物がプラスチック表面に吸着するのを防ぐため、ポリプロピレン製プレートの使用が推奨されます。化合物を保持するためには、V底の96ウェルプレートを使用することでデッドボリュームを最小限に抑えることができます。FLIPRピペッターを使用した場合、フラット底プレートのデッドボリュームは約50 µL、V底プレートでは約10 µLです。

化合物は、添加量および細胞プレート内のバッファ量に応じて、最終濃度の3倍、4倍、または5倍で調製します。これらの量は、化合物の混合効率、細胞の接着性、細胞応答の速度などの要因によって変化する可能性があります。

膜電位の測定は、細胞の迅速な反応を捉えるために迅速に行う必要があります。そのため、化合物を素早く細胞プレートに添加し、ウェル内の液体を効果的に混合する必要があります。ただし、化合物を急速に添加すると、一部の細胞がプレートから剥がれる可能性があります。大きな液量はウェル内での混合が速くなりますが、細胞層への影響が大きくなります。一方、小さな液量は細胞層への影響が少なく、同じ化合物プレートを複数の細胞プレートに使用することが可能です。接着性の弱い細胞を剥がさないようにするためには、化合物の添加量を少なくし、ピペッターの吐出速度を低速に設定することが推奨されます。

ノート：FLIPR膜電位測定キットでは、通常ピペッターの混合機能は使用しません。シグナルの立ち上がり中に混合を行うと、アーティファクトが生じる可能性があるためです。

FLIPRシステムの膜電位アッセイ設定パラメーター

アッセイを実施する前に、FLIPRシステムのFilter #2の位置にフィルターを取り付ける必要があります。FLIPRのフィルタードア内にあるフィルターホルダーの固定ネジ2本を外し、ホルダーを清潔なベンチまたはタオルを敷いた上に取り出します。Filter #2の位置が空であることを確認し、リングを反時計回りに回して取り外します。540–590 nm BP発光FLIPRフィルターを#2の位置に慎重に設置し、ノッチが外側を向くようにリングを元に戻して固定します。フィルターホルダーをFLIPRに正しく戻します。

基礎蛍光シグナルの確認

FLIPRソフトウェアの実験設定でFilter #2を選択します。レーザー出力、カメラの絞り値（f-stop）、露光時間の設定は、表1に示す値から開始することを推奨します。これらの設定は、基礎蛍光シグナルの測定に最も頻繁に使用されるものです。

表1： 細胞プレートの基礎蛍光シグナル測定におけるFLIPRハードウェア設定

データ取得の開始時には、化合物添加前の細胞からの基礎蛍光シグナルを確認する「シグナルテスト」を実施してください。背景値に対して20,000～30,000カウントの蛍光シグナルが得られるのが理想です（カメラの飽和は65,000カウント）。FLIPR IシステムとFLIPR384システムでレーザー光のプレート走査方法が異なるため、FLIPR384では同等の蛍光シグナルを得るためにFLIPR Iの約2倍のレーザー出力が必要です。

基礎蛍光シグナルの調整

以下のパラメーターを調整することで、適切な基礎蛍光シグナルを得ることができます：

露光時間

蛍光シグナルが高すぎる場合は、露光時間を最小0.05秒まで短縮できます。シグナルが低すぎる場合は露光時間を延長できますが、サンプリング間隔は「露光時間＋0.6秒」（データ統合に0.6秒必要）以上にする必要があります。

カメラのf値（絞り）

f値を上げると絞りが狭くなり、シグナルが低下します。シグナルが高すぎる場合は、f値を4.0から8.0に上げてください。シグナルが低すぎる場合は、レーザー出力を上げることが推奨されます。FLIPRシステムではf/2が最大開口設定です。

レーザー出力

シグナルが低すぎる場合はレーザー出力を上げ、高すぎる場合は下げてください。アッセイ中のレーザー出力は、FLIPR Iでは0.300～1.000 W、FLIPR³⁸⁴では0.600～2.000 Wの範囲が推奨されます。

露光時間

ノート：上記3つのパラメーターのうち、ほとんどのユーザーはレーザー出力と露光時間の2つを調整し、f値はプレート間で一定に保つ傾向があります。

膜電位アッセイにおけるピペッター設定

FLIPRシステムのソフトウェアでは、アッセイチャンバーの温度や液体分注のパラメーターを設定できます。

アッセイ温度

FLIPR膜電位測定キットの染料は、DiBACに比べて温度変化に対する感度が低いため、ほとんどのアッセイは室温で実施されます。ただし、一部の化合物や細胞種では、生理的温度でのアッセイの方が良好な応答を示すことがあります。FLIPR Iでは加熱オプションを選択、FLIPR³⁸⁴では加熱ステージを設定して加熱オプションを選択してください。アッセイ前に最低30分間、装置温度の平衡化時間を確保してください。

ピペッターの高さ

96ウェル用ピペッターでは、化合物プレートから液体を吸引した後、各チップの先端に空気の泡を少量吸引して液漏れを防ぎます。この泡が最初に吐出されるため、ウェル内で泡が発生すると光の反射やノイズの原因になります。これを防ぐため、液体吐出時にはチップ先端がウェル内液面より上にある状態で開始し、吐出後は液面下に沈めることで完全な分注を確保します。液体吐出終了時にチップが空気中にあると、表面張力により先端に液滴が残る可能性があります。例えば、ウェルに100 µLの液体があり、50 µLのサンプルを添加する場合、ピペッターの高さは120～140 µLの位置に設定するのが適切です。

384ウェルでは液面が深く湾曲しているため、化合物添加前の液量に応じた高さにピペッターを設定することが推奨されます。

液体分注速度

デフォルトの分注速度は、96ウェルプレートで50 µL/sec.、384ウェルプレートで20 µL/sec.です。表2には、両フォーマットにおける分注速度の上限値が示されています。

表2： 液体分注速度

これらの値は細胞種ごとに実験的に決定する必要がありますが、一般的には、ウェル内での化合物の混合を促進するために、可能な限り速く分注することが望ましいとされています。ただし、分注速度が速すぎると細胞がウェルから剥がれてしまう可能性があるため、その点には注意が必要です。

セクション III: 材料と方法

材料と設備

1. 540-590nmBP発光FLIPRフィルターを装着したFLIPRシステム（モレキュラーデバイス）
2. 膜電位測定キット（モレキュラーデバイス、R-8034）
3. 透明、平底、黒色または透明壁の 384 ウェルまたは 96 ウェルプレート（付録 A の消耗品リストを参照）
4. 透明ポリプロピレン複合プレート（付録Aの消耗品リストを参照）
5. 懸濁状態の細胞
6. 増殖培地
7. 試験化合物
8. インキュベーター（5% CO₂、37）
9. 遠心分離機
10. マイクロプレート用のピペッターと滅菌チップ
11. 1N NaOH

細胞の準備

ステップ1 96ウェルプレートでは100µL/ウェル、384ウェルプレートでは25µL/ウェルの細胞懸濁液を使用する。接着していない細胞は実験当日にプレーティングします。その後、ブレーキを外した状態で、プレートを1000 rpmで最大4分間遠心することを推奨します。接着細胞は実験前日に播種し、5％CO₂、37℃のインキュベーターで一晩培養します。80％～90％のコンフルエントな細胞単層を作製するために、表3に示す密度で細胞を播種することを推奨します。

表3： 推奨細胞播種密度。

染料ローディング

ローディングバッファーの調製

以下の手順は、上記のように調製した接着細胞または非接着細胞を用いて、96ウェルまたは384ウェルプレート10枚用にデザインされています。

ステップ 2 1X 試薬緩衝液を調製するため、10X 試薬緩衝液（膜電位測定キットのコンポーネント B）10mLを蒸留水で 100mLに希釈し、1N NaOHでpH7.4に調整します。

注意：時折、10X 試薬緩衝液のボトルに白い沈殿が生じることがあります。これは正常であり、アッセイには影響しません。

ステップ3 FLIPR膜電位測定試薬（膜電位測定キットのコンポーネントA）のバイアルを取り出します。10 mLの1X試薬バッファーでバイアルを完全に溶かします。完全に溶解するまでピペッティングを繰り返して混合します。バイアル瓶の混合液を90 mLの1X試薬バッファーに希釈し、ローディングバッファーを調製します。内容物を完全に移すには、バイアルを複数回洗浄する必要があります。

注意：供給された試薬は、細胞を適切にローディングするのに十分な量です。最適な結果を得るためには、試薬を追加したり、容量や濃度を変えたりしないことが重要です。

ローディング・バッファーを用いた細胞のローディング

ステップ 4 細胞プレートをインキュベーターまたは遠心機から取り出します。上清は除去しないでください。各ウェルに等量のLoading Bufferを加えます（96ウェルプレートでは1ウェルあたり100μL、384ウェルプレートでは25μL）。

ステップ5 細胞プレートを37℃で1時間インキュベートします。場合によっては、室温でインキュベートしても同等かそれ以上の効果があります。

FLIPRでの膜電位アッセイの実行

ステップ 6 Loading Bufferでのインキュベーション後、プレートを直接FLIPRに移し、FLIPRシステムマニュアルに記載されている通りにアッセイを開始しｍさう。推奨される実験セットアップパラメーターを表 4 に示します。

表4：実験セットアップパラメーター。

注：FLIPR膜電位測定キットはアゴニストだけでなくアンタゴニストの添加にも最適化されています。96ウェルプレートでは各ウェルに50µL、384ウェルプレートでは25µL添加します。アゴニストの添加量は変わりませんが、濃度とピペッターの高さは変わります。

セクションIV：トラブルシューティングガイド

このセクションでは、ユーザーが遭遇する可能性のある問題の解決策を紹介します。

1. 化合物添加時の蛍光低下
2. 細胞を長時間（例えば1時間以上）インキュベートする場合、FLIPR システムの化合物添加時に大きな蛍光低下（5-10K 蛍光単位）が起こることがあります。このような蛍光単位の低下は、化合物添加中にウェルから 細胞が外れたことが原因である可能性が高いです。インキュベーション時間を短くし、ポリ-D-リジンコートプレートに細胞をプレーティングする、FLIPRの添加速度を遅くするなどの方法でアッセイを最適化します。
3. 蛍光の増加
4. 緩衝液のみのチャレンジで蛍光の増加が観察されることがあります。この蛍光の増加は、イオン強度の増加に対する内因性イオンチャネルの反応による可能性が高いです。パッチクランプのデータもこの変化を裏付けています。細胞の選択と内在性チャネルの発現レベルは、静止膜電位と変化する膜電位に大きく影響する可能性があります。化合物添加時のイオン濃度が変化しないように、化合物添加バッファーとセルプレートのバッファー（培養液＋色素負荷バッファー）を合わせます。
5. 反応なし
6. 蛍光に変化がない場合、アッセイを再設計する必要があるかもしれません。推奨される方法としては、インキュベーションやアッセイ時間を長くする、Tyrodeís や特定のイオンを含まないバッファーなど、異なるバッファーを選択する、などがあります。例えば、カルシウムチャネルを研究する場合、カルシウムを含まないバッファーでロードセルを染色し、カルシウムを含むバッファーで化合物プレートを調製します。
7. 膜電位アッセイにおけるDMSOの影響
8. 高濃度のDMSOは多くの細胞株に対して毒性があり、化合物の混合に影響します。また、DMSOは細胞の生理的変化（分化など）を誘発する可能性があります。被験物質製剤にDMSOが含まれる場合、DMSOを滴定し、各指標細胞株と被験物質に使用できる最大濃度を決定することが重要です。試験した細胞株によっては、最終濃度1% DMSOまでシグナルレベルに影響がなかったです。

付録A：FLIPR膜電位アッセイで使用する消耗品

細胞培養施設で必要とされ、使用されるその他の物品：

• 5mL、10mL、25mL滅菌血清ピペット
• 2～25 mLピペット用充電式ピペッター
• 滅菌組織培養水
• 手袋
• 細胞培養用培地
• 細胞を浮遊させるためのEDTAとトリプシン/EDTA
• 血球計数器とカウンター
• 滅菌済み試験管15mLと50mL、または化合物希釈用の小さい試験管
• 1NのNaOH溶液
• 272

商標：FLIPRはモレキュラーデバイスの登録商標です。その他の商標は各所有者に帰属します。

FLIPR膜電位測定キットについてさらに詳しく >>