Application Note ヒト心筋細胞の肥大反応評価
BNP発現と細胞サイズのモニタリング
- 形態変化を可視化します
- 複数の肥大関連パラメータを同時に定量化します
- 96ウェルおよび384ウェルプレートで心筋細胞をスクリーニングし、スループットを最大化します
- アダプティブ取得を用いて統計的に有意なサンプルサイズを収集します
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はじめに
心筋肥大は、心筋梗塞、虚血、高血圧、弁機能障害など多くの心疾患に関連する状態であり、環境汚染物質や医薬品候補化合物の毒性副作用としても観察されます。この状態は、細胞サイズの増加やタンパク質合成の亢進など、さまざまな細胞変化を特徴とします。心筋肥大の古典的なバイオマーカーの一つはB型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）であり、肥大した心筋細胞では過剰に産生されます *1。
誘導多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞をハイコンテントイメージングアッセイでモニタリングすることで、化合物毒性による肥大の発症や改善をハイスループットで測定できます。これらのアッセイは、薬理試験や疾患モデルを用いた創薬におけるフェノタイプスクリーニングに有用な堅牢なツールです *2。
以下の実験では、ヒトiPSC由来のiCell® Cardiomyocytes（Cellular Dynamics Intl., Madison, WI）を用いて、細胞サイズの増加とBNPレベルの上昇による肥大検出を示しました。これらの細胞は、生化学的、電気生理学的、機械的、病態生理学的特性を再現することが示されており、エンドセリン-1（ET-1）で細胞を誘導することで肥大モデルを作成しました。肥大抑制化合物の効果は、ImageXpress® Micro ハイコンテントスクリーニングシステムとMetaXpress® ソフトウェアを用いてBNP発現と細胞面積を測定し、定量化しました *2。
ハイコンテントスクリーニングのためのアッセイ
心筋肥大のアッセイに関する詳細なプロトコール *1はCellular Dynamics Internationalから入手できます。ハイコンテントスクリーニングに容易に適応できる一般的なワークフローを図1に示します。総反応量は通常、384ウェルプレートで40 μLでした。
図1. ハイコンテントイメージングと解析によるスクリーニングのアッセイワークフロー
データ取得はImageXpress Microシステムで実施しました。画像は10倍または20倍の倍率で、DAPIおよびCy5フィルターを使用して2種類の波長で取得しました。アダプティブ取得により、384ウェルプレートでウェルあたり1000細胞以上を解析するために十分なサイトを自動的に収集しました。データ解析はMetaXpressソフトウェアのMulti-Wavelength Cell Scoringモジュールを使用しました。
関連する肥大分子・細胞バイオマーカーのハイスループットスクリーニング
化合物毒性による病的心筋肥大は、多くの分子および細胞変化を特徴とします。ヒト心筋細胞でこれらの変化を捉えることは容易であり、ハイスループットワークフローに適しています。以下の例では、分子および細胞レベルの肥大バイオマーカー測定を示します。
分子バイオマーカーの変化の定量化
BNPレベルの上昇は、心筋肥大中に発現が変化する多くのタンパク質の一つです。ここでは、BNPを蛍光抗体で標識し、細胞質内のBNP染色を測定することで、ハイコンテントイメージングを用いてBNP発現を評価しました（図2A）。この実験では、iCell CardiomyocytesをET-1の10段階希釈系列で処理しました。BNP信号を細胞ごとに化合物濃度の対数に対してプロットし、ET-1誘導によるBNP発現の用量反応曲線を作成しました（図2B）。この曲線からET-1のEC₅₀値を算出しました。
図2A. ET-1添加前後のiCell CardiomyocytesにおけるBNP発現 未処理（左）または10 nM ET-1で18時間刺激した細胞（右）の画像。BNP発現検出用抗体で標識（赤）、核はHoechst 33342で染色（青）。画像は20倍で取得。BNP信号の面積を用いてBNP発現レベルを算出しました *1。
図2B. 代表的な384ウェル実験におけるBNP発現の用量依存的増加 ET-1刺激後、BNP発現が濃度依存的に増加。ET-1のEC₅₀値は24 pM（平均±SEM；各点n=4）*1。
細胞サイズの変化の定量化
細胞サイズの増加とアクチン細胞骨格の構造再編は、肥大反応のよく知られた細胞特徴です *2。肥大を細胞サイズの増加で判定する方法を示すため、iCell CardiomyocytesをET-1で誘導し、染色後ImageXpress Microシステムでイメージングしました。肥大した心筋細胞は未処理細胞より明らかに大きく、MetaXpressソフトウェアで定量化した結果、BNP検出と同様のEC₅₀値を示しました（図3）。
図3. 未処理（左）と10 nM ET-1誘導（中央）のiCell Cardiomyocytesの画像 Alexa Fluor 488標識ファロイジンで細胞体サイズを測定（緑）、核はHoechst 33342で染色（青）。画像は20倍で取得。ET-1の滴定に対して細胞サイズ（平方ミクロン）を定量化し、EC₅₀値は11 pM（平均±SEM；n=3）（右）*2。
ハイスループットスクリーニングとヒト生物学を創薬初期に導入
肥大と心不全は創薬における一般的な治療領域です。ImageXpress Microシステムのハイスループット機能とヒト幹細胞由来組織細胞を組み合わせることで、創薬スクリーニングの初期段階でヒト生物学にアクセスできる完全なシステムを提供します。概念実証として、心筋細胞を各阻害剤の10段階濃度で4重複処理し、その後1 nM ET-1で刺激しました。阻害活性を示した化合物の例は、ベラパミル（カルシウムチャネル遮断薬）、BEZ-235（二重P13K-mTOR阻害剤）、シクロスポリンA（カルシニューリン阻害剤／免疫抑制剤）、フェノフィブラート（脂質低下薬）、SAHA（広範なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）です（図4）*2 。
図4. 複数の化合物プロファイリング実験からプロットした代表的データ iCell Cardiomyocytesは培養4日目に化合物の希釈系列で1時間処理後、ET-1（1 nM）で18時間肥大誘導。BNP発現の変化を化合物滴定に対して定量化。ベラパミル（黒丸）は最も強力な阻害剤で、IC₅₀値は35 nM *2。
サマリー
ヒトiPSC由来心筋細胞は、心筋肥大をモデル化するためのin vitro細胞システムを提供します。ハイコンテントスクリーニングを用いて薬物誘導心筋細胞をモニタリングすることで、治療の副作用としての肥大測定や、抗肥大化合物の試験モデル作成が可能です。BNP発現レベルや細胞サイズの変化など複数のパラメータを1回のアッセイで取得でき、肥大反応の微細な指標も観察できます。さらに、96ウェルおよび384ウェルフォーマットと自動イメージング・解析を組み合わせることで、ImageXpress MicroハイコンテントスクリーニングシステムとMetaXpressソフトウェアのMulti-Wavelength Cell Scoringモジュールを活用し、疾患モデル研究や薬理試験におけるフェノタイプスクリーニングを効率化します。
参考文献
- Modeling Cardiac Hypertrophy: Endothelin-1 Induction with High Content Analysis, iCell Cardiomyocytes Application Protocol, Cellular Dynamics International, January 2014. https://www.cellulardynamics.com/products/lit/CDI_iCellCM-Hypertrophy_ET1_HighContent_AP.pdf
- Phenotypic Screening with Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes: HTSCompatible Assays for Interrogating Cardiac Hypertrophy, Carlson, C., et al., J Biomol Screen, 2013, 18(10):1203-11, doi:10.1177/1087057113500812.
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