Application Note iPSC由来肝細胞を用いた
マルチプレックスハイコンテント肝毒性アッセイ

はじめに

薬剤誘発性肝毒性は、肝障害や急性肝不全の重要な原因である。そのため、安全性と有効性を試験するための予測性の高いアッセイは、医薬品開発を改善し、薬剤の減少を抑えるために極めて重要である。ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）由来の肝細胞は、成熟細胞の典型的な性質と代謝を示し、医薬品開発の初期段階におけるハイコンテントスクリーニングに理想的である。

ハイコンテントスクリーニングシステムで標準的なアッセイを実施するためのプロトコルは確立されていますが、様々な毒性を評価するために必要な画像解析は、複雑でカスタム駆動になる可能性があります。このノートでは、ImageXpress®Micro システムを用いたマルチパラメトリック肝毒性アッセイの開発について説明します。各ウェルまたはセルから複数の化合物による細胞応答が得られ、MetaXpress® ソフトウェアのカスタムモジュールを使用して解析します。

標準的な生存率アッセイからより多くの情報を得る

iCell Hepatocytes（Cellular Dynamics International）は、まず様々な化合物で72時間処理し、その後染色した。生細胞のイメージングをImageXpress® マイクロシステムの10X対物レンズで取得し、MetaXpressソフトウェアのMulti-Wavelengths Cell Scoringアプリケーションモジュールを用いて、生細胞の総核数（Hoechstカウンターステイン）と細胞質面積（Calcein AM）を解析した（図1）。

単一色素ミトコンドリア毒性アッセイ

ミトコンドリアの偏光解消は低酸素障害や酸化ストレスの初期シグナルである。ミトコンドリアの膜電位はJC-10色素で評価できる。無傷のミトコンドリアでは、オレンジ色のJ会合体が見えるが、膜が偏光解消すると、色素は細胞質に漏れ出し、フルオレセインの波長で蛍光を発する。肝細胞を化合物で60分間処理し、ImageXpress Microシステムでイメージングする前にJC-10で染色した。カスタムモジュールを用いて、染色を保持する健全なミトコンドリアと、細胞質に漏出した色素の量を定量した。この2つの強度の比は、どちらか一方の測定値のみよりもロバスト性の高い分析をもたらす（図2）。

リン脂質症と脂肪症は肝毒性の一般的な徴候である。

薬剤の中には、リン脂質や中性脂質の過剰蓄積を特徴とする脂質代謝障害であるリン脂質症や脂肪症を引き起こすものがある。肝細胞におけるリン脂質と中性脂質の量と分布は、イメージング法を用いて検出することができ、細胞単位で定量することができる。図3は、肝細胞を384ウェルプレートにプレーテ ィングし、選択した化合物で24時間処理する前に4日間 インキュベートした実験である。

毒性試験からより多くの情報を得る

MetaXpressSoftwareのカスタムモジュールエディターにより、研究者は関心のあるカスタムパラメーターを指定してマルチプレックスアッセイを行うことができる。セルのサイズや形状、生存細胞の総数、アポトーシスを定量するカスタムモジュールが実証されています（図4）。これらのモジュールを画像に適用し、MetaXpress® PowerCore™ハイコンテント分散画像解析ソフトウェアで大量に実行することで、ハイスループットなアプリケーションを実現できます。

マルチパラメーター肝毒性スクリーニングの完全なソリューション

マルチパラメトリック画像解析は、アッセイの感度を大幅に向上させ、化合物の毒性メカニズムに関する貴重な情報を提供します。MetaXpress®ソフトウェアのカスタムモジュールエディターにより、科学者は自由にカスタマイズされた画像解析モジュールを設計し、毒性アッセイを迅速に解析して、関連する出力のみを報告することができます。Molecular Devicesは、単純なライブ/デッドアッセイをはるかに超える、肝毒性を評価するための柔軟なハイコンテントスクリーニングソリューションを提供します。