Application Note PathCheckテクノロジーで
OD測定値を1cm光路長に自動補正

はじめに

UV/VIS分光光度計とマイクロプレートリーダーは、ビームの光学的構造において根本的に異なります。分光光度計では、サンプルはキュベットやチューブを通して水平（断面方向）の光路で測定されます。水平光ビームと一般的な1 cmの光路長により、消光係数に基づくアッセイが容易になり、ラボ間での結果比較も簡単です。一方、マイクロプレートリーダーでは、垂直方向の光ビームを使用するため、光路長は各ウェル内の液体容量に依存します。

マイクロプレートにおける光路長の変動は、消光係数に基づくアッセイを困難にし、マイクロプレートリーダーで得られた結果と分光光度計で得られた結果の比較を混乱させてきました。この問題は、モレキュラーデバイスのPathCheckテクノロジーの導入によって解決されました。このテクノロジーは、マイクロプレートの各ウェルにおける光路長を測定し、吸光度値を自動的に1 cmの光路長に正規化します。本テクニカルノートでは、PathCheckテクノロジーの原理を説明し、SpectraMax®マイクロプレートリーダーおよびSoftMax Proソフトウェアでの具体的な使用方法を示します。

Principles of PathCheck

近赤外測定による光路長補正

水は200 nmから900 nmまでほぼ透明ですが、近赤外（NIR）領域では977 nm付近に特徴的な吸収ピークがあります（図1）。この吸光バンドは、生体分子のほとんどが吸光度を示さないスペクトル領域に位置しており、水溶液中の光路長測定に利用できます。

ランベルトの光吸収則によると、吸光度は光がサンプルを通過する距離に比例します。光路長が長いほど、吸光ピークは高くなります。ベースライン吸光度は、水のピークから離れた波長（例：900 nm）で測定できます。マイクロプレートウェルで得られたピーク高さと標準的な1 cmキュベットで得られたピーク高さを比較することで、水溶液中の光路長を計算できます：

$$ \frac{(A_{280})_{\text{sample}} \times (A_{1000} - A_{900})_{\text{1.0 cm aqueous solvent}}} {(A_{1000} - A_{900})_{\text{sample}}} = A_{280,\text{sample corrected to 1.0 cm}} $$

実際には、977 nmは光路長測定に理想的な波長ではありません。なぜなら、その波長では水の吸収が温度に依存するためです。マイクロプレートとキュベットの測定がまったく同じ温度で行われない場合、光路長測定には誤差が生じます。SpectraMaxマイクロプレートリーダーは、温度依存性を回避するために、水の吸光度を温度のアイソベスティックポイント付近である1000 nmで測定します。

この方法のトレードオフは、測定が吸光曲線のピークではなく傾斜部分で行われるため、装置に優れた波長再現性が求められる点です。上記の式に示した比率を使用することで、マイクロプレートウェル内の水溶液サンプル（以下の例では280 nmにおけるタンパク質）の吸光度を、1 cmの光路長に「補正」することができます：

$$ \frac{(A_{280})_{\text{sample}} \times (A_{1000} - A_{900})_{\text{1.0 cm aqueous solvent}}} {(A_{1000} - A_{900})_{\text{sample}}} = A_{280,\text{sample corrected to 1.0 cm}} $$

あらかじめ設定されたWater Constant：簡便な方法

近赤外領域で吸収する物質は比較的少ないため、上記の式にある \( (A_{1000} - A_{900})_{\text{1.0 cm aqueous solvent}} \)は、水溶液の場合、実質的に一定値となり、これを「Water Constant」と呼びます。各SpectraMaxマイクロプレートリーダーにおけるWater Constantの値は、装置の製造時に決定され、ファームウェアにあらかじめインストールされています。UV/VIS領域で吸光度値を補正するための式において、\( (A_{1000} - A_{900})_{\text{1.0 cm aqueous solvent}} \) をWater Constantに置き換えると、次のようになります。：

$$ \frac{(A_{280})_{\text{sample}} \times \text{Water Constant}} {(A_{1000} - A_{900})_{\text{sample}}} = A_{280,\text{sample corrected to 1.0 cm}} $$

SpectraMaxマイクロプレートリーダーによる光路長補正

光路長を補正する2つの方法

SpectraMaxマイクロプレートリーダーでは、光路長補正を行う際に2つのオプションがあります。 1）装置のキュベットポートに清浄な1 cmリファレンスキュベットをセットし、キュベットのA₁₀₀₀およびA₉₀₀に基づいて計算を行う方法（キュベットポートを備えたリーダーのみ対応）、2）Water Constantを使用する方法です。キュベットリファレンスは、サンプル溶媒の塩や溶質濃度が0.5 Mを超える場合、有機溶媒を含む場合、または近赤外領域で異常な吸光度を示す場合にのみ必要です。Water Constantの使用は、精度がやや低くなる可能性があります。

SoftMax Proソフトウェアは、1 cm光路長に「補正」された吸光度測定値を報告するだけでなく、96ウェルそれぞれの光路長も報告できます。この機能は、マイクロプレートの容量の不均一性を確認したり、ピペッティングエラーを検出する際に有用です。PathCheckを用いた吸光度測定を行う場合、SoftMax Proソフトウェアは以下の計算手順を実行します。：

1. Plate Background ODの減算（Data Reductionで選択した場合）
2. 光路長補正（近赤外測定の比率を使用）
3. プレートまたはグループブランクの減算（該当する場合）
4. ユーザー指定のカスタムデータリダクション（該当する場合）

PathCheckの使用方法

準備

材料

1. SpectraMaxマイクロプレートリーダー
2. 高品質のUV透明マイクロプレート（石英またはUV透明ポリマーなど
3. ピペッターとマイクロプレート用に適したチップまたはトランスファーピペット
4. サンプル（各100～300 µL）

SoftMax ProソフトウェアでPathCheckを設定します

1. SoftMax Proソフトウェアを起動し、Plateセクションを開くか、必要に応じて新しいPlateセクションを作成します。
2. Table 1に示すようにInstrument Settingsを設定します。希望する波長でエンドポイントリードを実行するように設定し、PathCheckのチェックボックスをオンにします。その後、Water ConstantまたはCuvette Referenceボタンをクリックし、使用する方法を選択します。注：Cuvette Referenceはキュベットポート付きの装置でのみ利用可能です。
3. Template Editorを使用して、標準品と未知試料の配置を示すテンプレートを作成します。
4. ツールバーのData Reductionボタンをクリックして、Data Reductionダイアログボックス（図2）を表示します。「Apply PathCheck」のチェックボックスをオンにします。Plate Background ODを使用する場合（ウェルの容量が同一でない場合は必須）、「Apply Plate Background OD」のチェックボックスをオンにし、値を入力します。（手順は「Determination of Plate Background OD」を参照）Raw Data ModeをOptical Densityに設定します。Wavelength Optionsを設定します（例：単一波長リードの場合は「!Lm1」）。

表1：PathCheckを用いた吸光度測定の機器設定

Plate Background ODの決定

清浄な96ウェルマイクロプレートの各ウェルに、100～200 µLの脱イオン水を分注します。水は190～900 nmの範囲でほとんど光を吸収しないため、容量は厳密でなくても構いません。SpectraMaxマイクロプレートリーダーで、アッセイに使用する波長で吸光度を測定し、すべてのウェルのOD値を平均してPlate Background ODを求めます。この値をData Reductionダイアログボックスに入力します（図2参照）。

キュベットリファレンスを用いた光路長補正

注記：Cuvette Referenceは、キュベットポートを備えたSpectraMaxマイクロプレートリーダーでのみ利用可能です。

1. SoftMax Proソフトウェアを前述の手順で設定し、Instrument Settingsで「Cuvette Reference」を選択します。
2. 蒸留水またはサンプルの水溶媒を入れた清浄な石英またはガラス製キュベットをリーダーのキュベットポートにセットします。プラスチック製キュベットも一般的に使用可能ですが、アッセイに使用する前に性能を確認してください。
3. アッセイプレートをプレートリーダーのキャリッジにセットし、Plateセクションで「Read」ボタンをクリックします。

キュベットはプレートと同時に読み取られ、その近赤外吸光度値がPathCheckの計算に使用されます。
注記：蒸発による誤差を避けるため、サンプルをマイクロプレートに分注してから数分以内に測定してください。測定を遅らせる場合は、プレートを粘着シールで覆い、測定直前にシールを取り除いてください。

Water Constantを用いた光路長補正

注：cuvetteポートのないSpectraMaxマイクロプレートリーダーの場合、PathCheckの計算ではwater constantが自動的に使用されるため、機器設定にwater constantオプションは表示されません。

1. SoftMax Proソフトウェアを前述の手順で設定し、Instrument Settingsダイアログボックス（図3）で「Water Constant」を選択します。キュベットポートがないリーダーでは、「PathCheck」のチェックボックスをオンにするだけで構いません。
2. アッセイプレートをプレートリーダーのキャリッジにセットし、Plateセクションで「Read」ボタンをクリックします。

注記：蒸発による誤差を避けるため、サンプルをマイクロプレートに分注してから数分以内に測定してください。測定を遅らせる場合は、プレートを粘着シールで覆い、測定直前にシールを取り除いてください。

PathCheckを用いてマイクロプレートのピペッティングエラーを検出します

1. SoftMax ProソフトウェアでPlateセクションを選択するか、必要に応じてExperimentメニューから「New Plate」を選択して新しいプレートを作成します。
2. Instrument Settingsを表1に従って設定し、任意の波長でエンドポイントリードを選択します。注記：SoftMax Proソフトウェアでは、光路長の計算に使用しない場合でも、読み取り波長を入力する必要があります。PathCheckを選択し、Water ConstantまたはCuvette Referenceを利用可能な場合は選択します。
3. PlateセクションのツールバーでData Reductionボタンをクリックし、Data Reductionダイアログボックスを表示します。Wavelength Optionsのドロップダウンメニューから「!Pathlength」を選択します（図4参照）。
4. プレートを迅速に視覚化するために、グレースケールまたはカラーマップオプションを使用すると便利です。PlateセクションのツールバーでDisplay Optionsボタンをクリックし、Display Optionsダイアログボックス（図5）を開き、ドロップダウンメニューから「Gray scale」または「Color map」を選択します。必要に応じて、各ウェルに縮小値を表示することも可能です。
5. プレートを装置のキャリッジにセットし、「Read」ボタンをクリックします。

実験結果

実験デザインとキュベットの結果

黄色のpH 7バッファー溶液（例：Ricca Chemical Company cat. #1551）を使用して、SpectraMaxマイクロプレートリーダーとPathCheckの性能を示しました。このバッファーは426 nmに吸光度の最大値を持ちます。バッファーをGreiner製96ウェルクリアマイクロプレート（cat. #655101）のウェルに75～300 µL分注し、PathCheckを使用して1 cm光路長に正規化した吸光度を測定しました。

注記：75 µLは推奨されるウェルあたりの最小容量を下回りますが、限界容量で発生するばらつきを示すために含めました。

ツールバーで「New Cuvette Set」をクリックしてCuvette Setを作成し、Cuvette Set Templateダイアログボックスで「Cuvette」という新しいグループを作成し、3つのサンプルに「Buffer」という名前を付けました（図6）。

Cuvette Setの設定では、426 nmでエンドポイントリードを指定しました。脱イオン水を満たしたガラス製キュベットをSpectraMaxマイクロプレートリーダーのキュベットポートにセットし、ツールバーの「Ref」ボタンをクリックしてリファレンスリードを実行しました。その後、黄色バッファーを満たしたマッチングキュベットに交換し、黄色バッファーの吸光度を3回測定しました。図7は、Cuvette Setおよびグループテーブルに表示された吸光度値を示します。結果は、標準的な1 cmキュベットにおける黄色バッファーの426 nmでの吸光度が0.556であることを示しています。

後続のテストで使用するPlate Background ODは次のように測定しました。清浄な96ウェルプレートの各ウェルに150 µLの脱イオン水を分注しました。その後、SpectraMaxマイクロプレートリーダーで426 nmにおける吸光度を測定し、すべてのウェルのOD値を平均して0.039という値を得ました。この値をData Reductionダイアログボックスに入力しました（図2参照）。

黄色バッファーを同一ロットの別のマイクロプレートに、テンプレートに示すように75 µLから300 µLの範囲で分注しました（図8）。前回のテストで使用したキュベットはキュベットポートに残したまま、プレートをキュベットをリファレンスとして読み取りました。

光路長補正なしで表示されたプレートの光学濃度

図9は、Data ReductionダイアログボックスでPathCheckを選択解除した場合の結果を示します。プレートセクションは視覚化しやすいようにカラーマップで表示されています。予想どおり、光路長補正を行わない場合、吸光度値はマイクロプレートウェル内のサンプル容量が増加するにつれて増加します。ソフトウェアで計算された平均OD値は、75 µLグループで0.17、300 µLグループで0.52でした。

光路長補正を適用したプレートの光学濃度

図10は、同じデータセットにPathCheckを適用した結果を示します。プレートセクションはカラーマップで表示され、光路長補正後のOD値も表示されています。すべてのサンプル容量において、補正後の値はキュベットの値に近い結果となりました。

プレートデータを絶対光路長（cm）で表示

図11は、同じデータセットを絶対光路長で表示したものです。予想どおり、データのカラーマップ表示は、図10に示した補正前のOD値の表示と類似しています。計算された平均光路長値は0.23 cmから0.88 cmの範囲でした。

データを1つのグラフに統合

図12では、光路長補正の有無における426 nmでの吸光度を、光路長（cm）の関数としてプロットしました。予想どおり、補正前の吸光度値は光路長の増加（すなわちウェル内の容量増加）に伴って増加します。PathCheckを適用すると、補正後の吸光度値はほぼ同一になります。

考察

アドバイスと注意事項

適切な手順で光路長補正を行った測定値は、同じ溶液を1 cmキュベットで測定した値と比較して、2.5％以内の精度であるべきです。誤った結果の原因となる可能性があるのは、蒸発とPlate Background ODの未適用です。

蒸発

光路長補正のための式を再確認してください：

$$ \frac{(A_{280})_{\text{sample}} \times (A_{1000}-A_{900})_{\text{1.0 cm aqueous solvent}}} {(A_{1000}-A_{900})_{\text{sample}}} \;=\; (A_{280})_{\text{sample corrected to 1.0 cm}} $$

蒸発が発生すると、分母の\( (A_{1000} - A_{900})_{\text{sample}} \)の値が減少し、補正が過剰になります。（UV/VIS領域での読み取り値は、分析対象が揮発性でない限り変化しません。）この影響は、容量の小さいウェルで特に顕著です。ウェルに300 µLの溶液が入っていても、蒸発の影響は15分以内に約1％の誤差として現れます。蒸発による誤差を避けるため、サンプルをマイクロプレートに分注してから数分以内に測定してください。測定を遅らせる場合は、プレートを粘着シールで覆い、測定直前にシールを取り除いてください。

適切なバックグラウンド減算を行わない場合

PathCheckを使用してサンプルの光路長補正を行う際、SoftMax Proソフトウェアは次の計算手順を実行します：

1. 生の吸光度値からPlate Background ODを減算
2. 光路長補正（近赤外測定の比率を使用）
3. プレートまたはグループブランクの減算（該当する場合）
4. ユーザー指定のカスタムデータリダクション（該当する場合）

Plate Background ODの目的は、マイクロプレート間のウェル間ばらつきを補正することではなく、光路長補正を適用する前にプレート素材による吸光度を減算することです。Plate Background ODを計算するには、ウェルに水を入れた状態でプレートを読み取る必要があります。水を入れたウェルは、乾燥したウェルよりも一般的に吸光度が低いため、乾燥したプレートでPlate Background ODを取得すると、光路長補正後の吸光度値がキュベット値よりも低くなります。Plate Background ODを完全に省略すると、光路長補正後の結果は著しく高くなります。

干渉の可能性

光路長補正は水溶液での使用を目的としていますが、PathCheck測定をキュベットリファレンスで行う場合は、少量の有機溶媒を含んでいても許容されます。前述のとおり、光路長補正測定にはキュベットリファレンスの使用が強く推奨されますが、Water Constantをショートカットとして使用できる場合もあります。ただし、サンプル溶媒に高濃度（例：0.5 M以上）の塩やその他の溶質が含まれる場合、または有機溶媒を含む場合、近赤外吸光度値は水と異なる可能性があります。このような場合、Water Constantは適切ではなく、サンプル溶媒を含むキュベットリファレンスを使用して光路長補正測定を行うことが不可欠です。

近赤外吸光度を用いた光路長補正は、測定を妨げる要因がサンプル中に存在しない限り適切です。干渉の原因としては濁りが挙げられます。また、1000 nmと900 nmで差吸収を示す分子が高濃度で存在する場合も干渉します。生体物質のほとんどは900～1000 nmの範囲で吸収しませんが、フタロシアニン、クロロフィル、カロテノイド、フィコビリン、ミオグロビン、ヘモグロビン、ペルオキシダーゼなどのポルフィリン含有分子や関連分子、還元型リンモリブデート錯体などはこの範囲で吸収します。ただし、これらの干渉物質が水に対して無視できる程度に希釈されていれば、光路長補正は適用可能です。干渉物質がすべてのサンプルで一定濃度で存在する場合、干渉はリファレンスキュベットに干渉物質を含むサンプルを置くことで排除できます。

結論

PathCheckテクノロジーは、マイクロプレートにおける光路長のばらつきという問題を解決します。各ウェルの光路長を測定し、吸光度値を自動的に1 cmの光路長に正規化します。PathCheckは、温度に依存しない結果を保証するために1000 nmでの水の吸光度を利用します。PathCheckは、核酸、タンパク質、その他の分析対象の直接的な吸光度ベースの定量や、ピペッティングエラーの検出に使用でき、より信頼性の高い結果を提供します。

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