Application Note SpectraMaxマルチモードマイクロプレートリーダー向けに
最適化されたHTRF設定
PDF版（英語）
Caroline Cardonnel | Sr. Applications Scientist | モレキュラーデバイス
はじめに
CisbioのHTRFアッセイは、Gタンパク質共役型受容体、キナーゼ、細胞シグナリング、エピジェネティクス、バイオマーカーの領域を網羅するように進化してきました。タンパク質間相互作用、核内レセプターアッセイ、レセプター二量体化、リガンド結合、レセプター内部化、酵素アッセイなど、様々なtoolbox試薬やキットをご用意しております。
HTRFでは、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体という2つの蛍光体を用いて、タンパク質やその他の目的の生体分子を標識します。生体分子が相互作用すると、その近接によってドナー蛍光体からアクセプター蛍光体への蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が起こります。ドナーとして長寿命の蛍光性ランタニドクリプテートを用いることで、HTRFアッセイの時間分解蛍光検出が可能になり、化合物や他の物質からの短寿命バックグラウンド蛍光を最小限に抑えることができます。時間分解FRET（TR-FRET）をマイクロプレートリーダーで検出することにより、生体分子の結合を読み出すことができます。
最高の HTRF 結果を得るには、シスビオが設定した HTRF 性能仕様を満たすことが検証されたマイクロプレートリーダーが必要です。リーダーの光学系、エネルギー源、検出器、および HTRF 検出に使用する設定はすべて性能に影響します。当社のプレートリーダーは、SpectraMax i3x® および Paradigm マルチモードマイクロプレートリーダー用のHTRF検出カートリッジ、SpectraMax iD5 プレートリーダー用の改良TRFモジュールとバリデーション済みフィルターなど、HTRF検出用に最適化されたコンポーネントを使用しています。
シスビオのHTRF認証プログラムは、「HTRF適合」ロゴの付いたリーダーがHTRFの最適な性能に必要な特異性を満たしていることを保証するものです。このテクニカルノートでは、モレキュラーデバイス製HTRF適合マイクロプレートリーダーのためにCisbioが検証した最適化設定を紹介します。
モレキュラーデバイス HTRF適合マイクロプレートリーダー
- SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
◦HTRF検出カートリッジ（モレキュラーデバイス P/N 0200-7011、またはTb/green用のカスタムTR-FRET） - SpectraMax® iD5マルチモードマイクロプレートリーダー
◦HTRF検出システム（モレキュラーデバイス P/N 6590-0144、改良TRFモジュール、励起およびリングフィルターを含む） - SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー
◦HTRF検出カートリッジ（モレキュラーデバイス P/N 0200-7011、またはTb/green用カスタムTR-FRET） - SpectraMax® M5e マルチモードマイクロプレートリーダー
- FlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダー
図1. HTRF適合SpectraMaxマルチモードプレートリーダー。SpectraMax i3/i3xおよびParadigmプレートリーダーには、HTRF検出 カートリッジを取り付けることができます。SpectraMax iD5プレートリーダーは、改良TRFモジュールと励起および発光用フィルタを含むHTRF検出システムを使用します。
プレートリーダー設定の推奨について
HTRFアッセイには3種類のドナー／アクセプター蛍光体の組み合わせがあり、最適な結果を得るためには、それぞれ特異性のあるプレートリーダー設定が必要です：
- ユーロピウムクリプテートドナー/レッドアクセプター（Eu/red）
- テルビウムクリプテートドナー/赤アクセプター（Tb/赤）
- クリプ酸テルビウムドナー／緑アクセプター（Tb/緑）、 Tag-lite
SpectraMax i3/i3xプレートリーダー
| Parameters | Settings | |
|---|---|---|
| Europium cryptate donor / red acceptor, Terbium cryptate donor / red acceptor | ||
| Optical configuration | Cartridge | HTRF |
| Read mode | TR-FRET | |
| Read type | Endpoint | |
| Wavelengths | Fixed per cartridge | Ex 340, Em1 616, Em2 665 |
| Plate type | User selectable | White plate required for high-performance HTRF measurement |
| Read area | User selectable | |
|
PMT and optics
|
Number of pulses
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
30
0.05 (fixed)
0.03 ms
0.4 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
|
Terbium cryptate donor / green acceptor, Tag-lite |
||
|
Optical configuration |
Cartridge |
Custom TR-FRET (Tag-lite HTRF) |
|
Read mode |
TR-FRET
|
|
|
Read type |
Endpoint
|
|
|
Wavelengths |
Fixed per cartridge |
Ex 340/80, Em1 616/15, Em2 665/10 |
|
Plate type |
User selectable |
White plate required for high-performance HTRF measurement |
|
Read area |
User selectable |
|
|
PMT and optics |
Number of pulses
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
30
0.05 (fixed)
0.03 ms
0.4 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
SpectraMax Paradigmプレートリーダー
| Parameters |
Settings |
|
|---|---|---|
| Europium cryptate donor / red acceptor, Terbium cryptate donor / red acceptor | ||
|
Cartridge |
HTRF | |
| Read mode |
TR-FRET |
|
|
Read type |
Endpoint | |
| Wavelengths | Fixed per cartridge | Ex 340, Em1 616, Em2 665 |
| Plate type | User selectable | |
| Read area | User selectable | |
| PMT and optics |
Number of pulses
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
30
0.05 (fixed)
0.03 ms
0.4 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
| Terbium cryptate donor / green acceptor, Tag-lite | ||
| Cartridge | Custom TR-FRET (Tag-lite HTRF) | |
| Read mode | TR-FRET | |
| Read type | Endpoint | |
| Wavelengths | Fixed per cartridge | Ex 340/80, Em1 616/15, Em2 665/10 |
| Plate type | User selectable | |
| Plate type | User selectable | |
| PMT and optics |
Number of pulses
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
30
0.05 (fixed)
0.03 ms
0.5 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
SpectraMax iD5プレートリーダー
| Parameters | Settings | |
|---|---|---|
| Europium cryptate donor / red acceptor, Terbium cryptate donor / red acceptor | ||
| Read mode | TR-FRET | Enhanced TRF module must be installed |
| Read type | Endpoint | |
|
Wavelengths |
Use filters |
Ex 340/70 Em1 665/10 Em2 616/10 |
| Plate type | User selectable | |
| Read area | User selectable | |
| PMT and optics |
Flashes per read
Excitation time (fixed)
Measurement delay
Integration time
Read height |
50
0.05 (fixed)
0.1 ms
0.6 ms
Plate format- and volume-dependent; optimize for each new plate type or volume used |
SpectraMax M5eおよびFlexStation 3プレートリーダー
| Parameters | Settings | |
|---|---|---|
| Europium cryptate donor / red acceptor | ||
| Read mode | TR-FRET | |
| Read type | Endpoint | |
| Wavelengths | Number of wavelength pairs: 2 | Ex 314; Em1 620, with 570 cutoff; Em2 665, with 630 cutoff |
| Plate type | User selectable | White plate required for high performance HTRF measurement |
| Read area | User selectable | |
| TRF settings |
Integration delay
Integration time |
50
300 |
| PMT and optics |
Flashes per read |
50 to 100 |
| Terbium cryptate donor / red acceptor | ||
| Read mode |
TR-FRET |
|
| Read type |
Endpoint |
|
| Wavelengths |
Number of wavelength pairs: 2 |
Ex 340; Em1 620, with 570 cutoff; Em2 665, with 630 cutoff |
| Plate type |
User selectable |
White plate required for high performance HTRF measurement |
| Read area |
User selectable |
|
| TRF settings |
Integration delay
Integration time |
50
300 |
| PMT and optics |
Flashes per read |
50 to 100 |
結論
時間分解蛍光検出機能を備えたSpectraMaxマルチモードマイクロプレートリーダーは、Cisbio社の標準的な認証方法によりHTRF性能の完全なテストを受け、HTRF認証の要求基準を上回る優れた性能を示しました。最適化された検出カートリッジまたはフィルターは、Tag-liteを含むあらゆるHTRFアッセイをサポートします。
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