Application Note 疾患モデリングとin vitro
薬剤スクリーニングのためのオルガノイド
- 自動化されたイメージングと解析により、オルガノイドの表現型変化のスループットと定量的評価を向上させる。
- オルガノイドのモニタリング、維持、特性解析の自動ワークフロー化
- 機械学習ツールを用いたオルガノイド画像解析の複雑性の克服
PDF版（英語）
はじめに
Oksana Sirenko, PhD | Sr. Scientist | Molecular Devices
Angeline Lim, PhD | Applications Scientist | Molecular Devices
Mary Kassinos | Cell Culture Technician | Molecular Devices
様々な組織を表現する3D細胞モデルは、複雑な生物学的効果、組織構造、機能性の研究に成功裏に使用された。しかしながら、3Dモデルの複雑さは、研究や薬剤スクリーニングに広く採用するためのハードルのままである。
我々は、オルガノイドと幹細胞の成長と分化の自動モニタリング、維持、特性評価、および様々な化合物の効果試験を可能にする自動化統合システムについて述べる。この自動化統合システムには、ImageXpress® Confocal HT.aiハイコンテントイメージングシステム、自動インキュベーター、Biomek i7 Hybridワークステーション、ロボット装置が含まれる。
このワークフローは、化合物スクリーニングに不可欠なオルガノイドアッセイにおいて、自動化と高度なハイコンテントイメージングがスループットと情報量を向上させる有用性を実証している。
方法
セル培養
3D肺オルガノイド： 3D肺オルガノイドは初代ヒト肺上皮細胞（ScienCell）から得た。セルはScienCellのプロトコールに従って2Dで培養、増殖させた。3Dオルガノイド培養には、PneumaCult™気道オルガノイドキット（STEMCELL Technologies）をメーカーのプロトコールに従って使用した。簡単に説明すると、細胞を24ウェルプレートフォーマットの90％マトリゲル（コーニング社製）ドームに播種し（1ウェルに1ドーム）、PneumaCult気道オルガノイド播種培地を用いて2週間、2日おきに栄養を与えた。その後、PneumaCult Airway Organoid分化培地を用いて、さらに6週間分化を行った。
細胞のモニタリングとイメージング
透過光（TL）蛍光画像をImageXpress Confocal HT.aiシステム（Molecular Devices）でMetaXpress® ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアを用いて取得した。オルガノイドについては、4Xまたは10X対物レンズを用い、共焦点モードでZ-スタック画像を取得した。MetaXpress®ソフトウェアまたはIN Carta®画像解析ソフトウェアをすべての解析に使用した。
研究成果
3D肺オルガノイドの培養とイメージング
3D肺オルガノイドは、成長因子を混合したマトリゲル中で培養した初代ヒト肺上皮細胞から作製した。オルガノイドを透過光でモニターし、自動共焦点イメージングを用いてマトリゲルを透過して染色・画像化した（図1）。画像解析には従来のツールとAIベースのツールが用いられた。発育中のオルガノイドは、空洞、突起、小胞構造を含む複雑な形態を持つ球形の対物レンズで構成されていた。6～8週間の発生期間中、サイズと複雑さの増大がモニターされた。高度な画像イメージングにより、3Dオルガノイドの再構成と、細胞形態、生存率、分化マーカーの複雑な解析が可能になった。我々は、疾患表現型や化合物効果の研究に利用可能な、オルガノイドの複数の定量的記述子を特徴付けた。肺毒性を引き起こすことが知られているいくつかの薬剤の濃度依存的効果を測定した（図2）。
図1. A. 培養4週間後のマトリゲルドーム内のオルガノイド、TL画像（4X、10X）。B. Hoechst色素（青）とMitoTracker（赤）で染色した培養6週間後のオルガノイド、10倍。共焦点オプションを使用して撮影したオルガノイド、10μm間隔で23枚の画像をZ-スタック取得。最大プロジェクション画像。C. カスタムモジュールエディター（MetaXpress®ソフトウェア）を用いた画像解析。オルガノイド、細胞、細胞内構造の検索。
図2. A. 発育6週間後、オルガノイドを10μMのイブルチニブで72時間処理した。オルガノイドをHoechst核色素（青）とEtHD-1（赤）で染色して死細胞を検出し、ImageXpress® Confocal HT.aiシステムを用いてイメージングした。EtHD-1陽性（死細胞）と陰性（生細胞）の数を3D解析で数え、EC50を決定した。
オルガノイド培養は初代肺上皮細胞から開始し（Methodsのセクションを参照）、STEMCELL Technologies社の試薬とプロトコルを用いてマトリゲルドーム内でオルガノイドを増殖させた。簡単に説明すると、まず細胞を2Dで展開し、次にGFで還元したマトリゲルと混合し、24ウェルまたは96ウェルプレートフォーマットのマトリゲルドームにプレーティングした（図1）。
細胞培養とイメージングプロトコルの自動化
オルガノイドは疾患モデリングと化合物効果の評価に不可欠なツールである。オルガノイドの表現型変化を定量的に評価し、実験や試験のスループットを向上させるためには、オルガノイドのイメージングと解析を自動化することが重要である。
我々は、オルガノイドと幹細胞の成長と分化の自動モニタリング、維持、特性評価、および様々な化合物の効果試験を可能にする自動化統合システムを構築した。この自動化統合システムには、ImageXpress Confocal HT.aiシステムと解析ソフトウェア、自動CO2インキュベーター、Biomek i7化リキッドハンドラー、協働ロボットとレール、さらにオプション機器（自動遠心機、ImageXpress® Picoシステム、プレートリーダー）が含まれている。
自動オルガノイドワークフローの構成要素
結論
- 細胞培養、維持、分化を自動化した3D細胞モデルは、様々な化合物アッセイのスクリーニングに利用できる。
- 細胞培養は、オルガノイドの検出と特徴付けを可能にするAIベースの画像解析により、透過光でモニターすることができる。
- 3D解析と組み合わせた共焦点イメージングにより、オルガノイドの細胞内容の複雑で定量的な解析が可能になり、異なる表現型（細胞数、生死判定、特異性マーカーによる細胞スコアリングなど）を持つ細胞の計数・測定も可能になります。この方法は、さまざまな化合物の効果の試験、毒性評価、疾患モデリングに利用できる。
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