Application Note 赤ワインのフェノール化合物測定

はじめに

赤ワイン中のタンニン、鉄反応性フェノール、アントシアニン、高分子色素の測定は、ワイン産業における品質管理の重要な部分である。ワイン中のフェノール化合物の正確で信頼性の高い測定は、発酵、マセレーション、圧搾、ブレンド時の意思決定に不可欠である。Harbertsonらは2003年、包括的な赤ワインフェノール測定法を開発した1。従来、この測定法はキュベットベースのUV-vis分光光度計を用いて行われていた。個々のサンプルを別々のキュベットで読み取り、結果を記録し、データを分析するという、時間と手間のかかる作業である。Herediaらは、迅速で費用対効果の高いアッセイ法の必要性を認識し、このアッセイ法をマイクロプレートプラットフォームに適応させた。このアプローチにより、労力、時間、サンプル量に関するスループットが向上した。このアッセイは、平均的な規模のワイナリーでフェノール化合物の抽出のために発酵をモニターする能力を広げる。ここでは、Molecular Devices SpectraMax® Plus 384マイクロプレートリーダーとSoftMax® Proソフトウェアを使用して、このアッセイのデータを効率的に収集および解析する方法について説明します。

SpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダーのユニークな機能の一部をご紹介します：

• 波長範囲： 190-1000 nm（1nm単位
• デュアルモノクロメーターベースの光学系により、フィルターが不要（図1）
• 測定速度：96ウェル：9秒 384ウェル：29秒
• 温度 周囲温度より4℃高い温度から45℃まで
• キュベットポート： 標準キュベットおよび12 x 75 mm試験管に対応
• OD範囲 0-4 OD

赤ワインフェノール測定法

Adams/Harbertsonアッセイは、分光光度法、タンパク質沈殿法、および重亜硫酸塩漂白法を使用して、赤ワインのフェノールを測定します。

PathCheck®センサー

PathCheck®センサーは、マイクロプレートウェル内のサンプルの光路長を測定するMolecular Devices社の温度に依存しない機能です。マイクロプレートウェルの吸光度を1cmキュベットの吸光度に正規化する画期的な方法です。

ランベルト・ランベールの法則は以下の通りです。
吸光度 = E * C * L

ここで

E = 吸光度（消衰係数）

C = 濃度

L = 光路長

キュベットの場合、光路は水平である。したがって光路長は固定され、1cm に等しい。しかしマイクロプレートの場合、光路は垂直です。そのため、光路長はサンプルの体積に依存します（図2）。PathCheck®センサーはこの不一致を補正します。

SoftMax® Proソフトウェア

このソフトウェアは、インストゥルメンテーションの制御、データ収集、完全なデータ解析を行います。適切なインストゥルメンテーション設定と計算を含むカスタムプロトコルを事前に作成し、保存することができます。エンドユーザーは、設定済みのプロトコルを開くだけで、プロトコルのセットアップ時間をかけることなく、完全な結果と解析を得ることができます。

材料

• ワインのサンプル ピノ・ノワール（ソノマ・コースト）
• マレイン酸（フィッシャーサイエンティフィック cat.）
• ウシ血清アルブミン (Sigma cat. #A3803-10G)
• トリエタノールアミン (Sigma cat.#T1377-100 mL)
• 塩化第二鉄六水和物（Sigma cat.#236489-100G）
• (+)-カテキン（Sigma cat.#C1251-5G）
• 酢酸（Sigma cat.）
• 塩化ナトリウム (フィッシャーサイエンティフィック社製 cat. #S271-3)
• ・水酸化ナトリウム（フィッシャーサイエンティフィック社，商品番号S318-500）
• エタノール（Acros社のカタログ番号61509-0040）
• 酒石酸カリウム (Sigma cat. #243531- 500G)
   

インストゥルメンテーションとアクセサリー

• SpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製、型番：PLUS 384）
• UV透明96ウェルマイクロプレート (Costar cat. #3635)
• トランスファーペットマイクロピペット（Drummond Scientific cat. #Drummond Digital Microdispenser cat. #3-000-510)
• マイクロピペット用マイクロチップ (Eppendorf 社のカタログ番号 #epT.I.P.S.; Reloads 社のカタログ番号 #022491539, 022491512, 022491547)
• マイクロフュージチューブ用遠心分離機（エッペンドルフ社製 cat.）
• 容量1.5 mLのマイクロフュージチューブ（Eppendorf社のカタログ番号022364111、022363557、022363514、2236357-3）

表1. 包括的赤ワインフェノール測定用試薬の調製（Harbertson et al.
. 2003, Picciotto 2002より要約）。

測定方法

カテキン標準曲線

マイクロプレートにカテキン 0～300 mg/L の範囲をカバーする希釈液を二重に作製した。プレートをシェーカーで振とうし、各ウェルに塩化第二鉄溶液38 µLを添加した。プレートを振とうし、さらに10分間インキュベートした後、吸光マイクロプレートリーダーで510 nmの吸光度を読み取った。ブランクとして緩衝液Cを用いた。

タンニン分析

希釈したワインサンプル500 µLを1.5 mLマイクロフュージチューブに加えた。次に、BSAを含む緩衝液A（最終濃度1 mg/mL）1 mLをチューブに加え、チューブを反転させて試薬を直ちに混合した。13,500gで遠心し、タンニン-タンパク質複合体をペレット化した。262μLのアリコートをマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーで510nmの吸光度をブランクとして読み取った（タンニンのバックグラウンド測定）。38μLの塩化第二鉄試薬を各ウェルに加え、マルチチャンネルピペッターで混合し、室温で10分間インキュベートした。ブランクとしてバッファーCを用い、510 nmで2回目の読み取りを行った（タンニン最終測定）。各サンプル中のタンニン量を表2に記載したように算出し、mg/Lカテキン当量で表した。

a 略号： CE：カテキン当量；IRP：鉄反応性フェノール；M-3-G：マルビジン-3-グルコシド；LLP：大重合体色素；SPP：小重合体色素；AU：吸光度単位。c "Abs due tannin" (y)をカテキン標準曲線の直線の方程式に挿入してxについて解き、y = mx+b とすると、タンニン = x = (y-b)/m。

表2. 包括的赤ワインフェノール測定法の計算概要（Harbertson et al.）

鉄反応性フェノール（IRP）分析

15µLの希釈していないワインサンプルをマイクロプレートウェルに加え、続いて247µLの緩衝液Cを加えました。反応は室温で10分間インキュベートされ、ブランクとしてバッファーCを用いて510 nmの吸光度が測定されました（IRPバックグラウンド測定）。この後、38μLの塩化第二鉄を各ウェルに添加した。試薬はマルチチャンネルピペッターで混合した。反応を室温で10分間インキュベートし、吸光度を510 nmで測定し、ブランクとしてバッファーCを用いた（IRP最終測定）。各サンプル中のIRP量を表2に記載の方法で算出し、mg/Lカテキン当量で表した。

アントシアニン分析

希釈したワインサンプル500 µLを1.5 mLマイクロフュージチューブに加えた。次に、緩衝液Aを1 mL加え、チューブを反転させて試薬を直ちに混合した。300μLのアリコートをマイクロプレートのウェルに二重に移し、室温で10分間インキュベートした。ブランクとして Buffer A を用い、520 nm で測定 A を得た。

希釈したワインサンプル50µLを各ウェルに加え、続いて緩衝液Bを50µL加えました。室温で10分間インキュベートした後、520 nmの吸光度を測定した（測定D）。各ワインサンプル中のアントシアニン量は、表2に記載の方法で算出し、mg/L マルビジン-3-グルコシド（M-3-G）単位で表した（Picciotto, E.A., et al.）

インストゥルメンテーションのセットアップ

インストゥルメンテーションはSoftMax Proソフトウェアでプログラムした。設定はソフトウェアのプレートセクションで行った（図4）。

ステップ 1. エンドポイント測定を選択しました。

ステップ2. 波長オプションに適切な数値を入力し、波長を510 nm（タンニン、カテキン、鉄反応性フェノール）または520 nm（測定A、B、C、D）に設定しました。

ステップ3. "PathCheck "オプションが選択された。反応が水性環境で行われた場合、"Water Constant "オプションが選択され、ソフトウェアはファームウェアに含まれる定数を使用した。反応が非水環境で行われた場合は、キュベットリファレンスオプションが選択された。この読み取りの間、有機緩衝液で満たされたキュベットがキュベットポートに挿入された。インストゥルメンテーションはキュベットから読み取った値を、経路長の補正に使用した。

ステップ 4. 自動混合が選択されていない。

ステップ 5. オートキャリブレーションにより、インストゥルメンテーションは選択された波長に対して自らキャリブレーションを行った。

ステップ6. 適切なプレートフォーマット・ウェルが選択されました。

テンプレートのセットアップ

一連の濃度を適切なウェルに配置するためのテンプレートがソフトウェアで設定されました。柔軟なテンプレートレイアウトにより、より多くのサンプルや複製を簡単に追加できます。

図5はカテキン標準曲線用のテンプレートセットアップの例です。残りの分析にも適切なテンプレートを設定しました。

測定結果

カテキン標準曲線

カテキンの標準曲線（0～300 mg/mL）をMaterials and Methodsに従って作成した。SoftMax® Proソフトウェアは、ブランクを自動的に差し引き、平均値、標準偏差、%CVを算出した。また、カテキン濃度に対する510 nmのODの標準曲線をプロットし、内挿法でワインサンプル中のタンニン濃度とIRP濃度を算出するために使用しました。ゼロ・カテキン濃度は、グループ・セクションの下にあるサマリー行の下に引き出されていることに注意（図7）。

タンニンの分析

タンニンの分析は、「材料と方法」に記載された方法で行った。タンニンによる光学濃度を以下の式で計算するようにソフトウェアをプログラムした：

タンニンによる光学濃度 = {(タンニン最終濃度)-(ゼロカテキン)}-(タンニンのバックグラウンド * 0.875)

ソフトウエアは、カテキングループセクションのサマリーラインからカテキンのゼロ濃度のODを利用した。タンニン濃度は、反応希釈とワインの希釈を考慮した補正係数を適用した後、カテキン標準曲線から内挿法で計算した。この例では、ワインを希釈していないため、希釈係数は使用しなかった（図8）。

鉄反応性フェノール（IRP）の分析

IRPの分析は、材料と方法のセクションに記載されているように実施した。IRPによる光学濃度を以下の式で計算するようにソフトウェアをプログラムした：

IRPによる光学濃度 = {(IRP final)-(Zero catechin)}-(IRP background * 0.875)

ソフトウエアは、カテキン群セクションのサマリーラインからカテキン濃度ゼロのODを使用した。IRP濃度は、ワインの希釈を考慮した補正係数を適用した後、カテキン標準曲線から内挿法で算出した（図9）。

アントシアニンの分析

アントシアニンの分析は、Materials and Methodsに記載された方法で行った。アントシアニンの濃度を以下の式で計算するようにソフトウェアをプログラムした：

((測定値D*10)-(測定値A*5)) /0.0102

ここで、10と5はそれぞれの希釈倍率を表し、0.0102はアントシアニン濃度をマルビジン- 3-グルコシド（M-3-G）単位で表すのに必要な換算係数である（Picciotto, E.A.ら）（図10）。

結論

• SpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダーは、Herediaらが96ウェルのマイクロプレートで行った赤ワインフェノール測定に適しています。
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーなど、吸光度検出モードを備えた他の Molecular Devices製リーダーも、このアプリケーションに使用できます。
• マイクロプレートフォーマットの使用はコストと時間の両面で効果的である。
• SpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダーの調整機能とPathCheck®センサー機能は、より高い精度と正確性を実現するのに役立ちます。
• SoftMax Proソフトウェアは、複雑で大規模なデータセットの解析や計算に便利なツールです。あらかじめ書き込まれたすぐに使用できるプロトコル、カスタムプロトコル、適切なグラフオプションが用意されています。
• Molecular Devices StakMax® マイクロプレートハンドリングシステムは、SpectraMaxマイクロプレートリーダーと統合し、20、40、50マイクロプレートのバッチ処理を自動化します。

参考文献

1. Harbertson J Fら; (2002) Am J Enol Vitic 53: 54-59
2. Harbertson J Fら; (2003) Am J Enol Vitic 54: 301-306.
3. Harbertson J Fら; (2004) Am J Enol Vitic 55: 295A.
4. Heredia T Mら; (2006) Am J Enol Vitic 57: 497-502.
5. Picciotto E Aら; (2002) Thesis, University of California, Davis.

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