Application Note 自動化されたイメージングを用いた
抗がん剤作用の表現型解析
- 同定された化合物の関連性
- 創薬成功率および生産性の向上
- 表現型スクリーニングにおけるトランスレーショナル・バイオマーカー
- 生細胞および固定細胞の染色プロトコルに伴う細胞毒性作用
PDF版（英語）
はじめに
Matthew Hammer、Oksana Sirenko｜Applications Scientists｜モレキュラーデバイス
抗がん剤の探索および評価は、細胞ベースモデルの開発、新規化合物のスクリーニング、薬剤効力の比較、ならびに作用機序の理解を含む、活発に進められている研究領域となります。特定の標的（精製受容体や酵素など）の活性を調節する化合物を評価する target-based drug discovery とは対照的に、phenotypic drug discovery は新規の作用機序を有する first-in-class 薬剤をより多く創出していることが示されています1–3。 Phenotypic drug discovery は、細胞ベースの疾患モデルに化合物を添加し、細胞死、増殖阻害、アポトーシスなど、望ましい表現型変化を誘導する薬剤を同定することを基盤としております2。
Phenotypic スクリーニングおよび多パラメーター解析への関心の高まりに伴い、細胞ベースアッセイにはより高い複雑性が求められております。自動化されたイメージングは、複数のリードアウトを同時にモニタリング可能であり、phenotypic drug discovery における重要なツールとなります4。化合物処理による細胞レベルおよび細胞内小器官レベルの影響、細胞毒性、あるいは生物学的経路の阻害に関する情報は、候補治療薬の作用機序をより深く理解するうえで有用です。
自動化された細胞イメージングは、抗がん化合物が細胞に及ぼす影響を解析するうえで効率的な手法となります。本稿では、ImageXpress® Nano Automated Imaging System と CellReporterXpress Automated Imaging and Analysis Software を組み合わせることで、抗がん化合物処理が細胞増殖、細胞生存率、細胞形態に与える影響の解析をどのように簡素化できるかをご紹介いたします。
私たちは、細胞生存マーカー、細胞形状の特徴解析、細胞接着およびスプレッディング、核凝縮、細胞骨格の完全性、ミトコンドリア膜電位など、複数の表現型を特徴づけるためのツールを提供するイメージングおよび解析手法を開発しました。
方法
抗がん化合物ががん細胞に及ぼす影響を評価するため、HeLa 細胞を 384 ウェルの黒色・透明底マイクロプレートに低密度（1,250 細胞／ウェル）で播種し、37°C、5% CO₂ 条件下で 24 時間インキュベートいたしました。 その後、抗がん化合物溶液を 1:3 の希釈系列で添加し、48 時間処理を行いました。化合物処理は 4 反復で実施しております。
各化合物の最高濃度は以下のとおりです： staurosporine（10 μM）、mitomycin C（300 μM）、paclitaxel（30 μM）、etoposide（300 μM）、doxorubicin（100 μM）。
画像 1. AlexaFluor488 phalloidin で染色した HeLa 細胞の 40x 画像です。代表的な画像は、化合物処理に応答して生じる HeLa 細胞の表現型変化を示しております。画像は ImageXpress Nano システムと CellReporterXpress ソフトウェアを用い、40x Plan Fluor 対物レンズで取得いたしました。観察される表現型変化として、アポトーシス核、細胞の脱着、細胞面積の変化、phalloidin 染色強度の変化、核数および核形状の変化が挙げられます。各化合物の薬剤濃度は、B が staurosporine（0.12 μM）、C が paclitaxel（5.1 × 10⁻⁴ μM）、D が paclitaxel（1.7 × 10⁻⁴ μM）、E が mitomycin C（0.41 μM）、F が etoposide（3.7 μM）となります。
抗がん化合物を 48 時間処理した後、細胞を Hoechst、Calcein AM、MitoTracker Orange の 3 種の蛍光色素の組み合わせで染色いたしました。2x の染色溶液を培地へ直接添加し、最終的な染色濃度は、Hoechst 33342 が 6.75 μM、MitoTracker Orange が 0.5 μM、Calcein AM が 1.25 μM（Life Technologies または EarlyTox™ Live Cell Assay Kit）となるように調製しております。
細胞は 37°C、5% CO₂ 条件下で 30 分間染色溶液とともにインキュベートいたしました。生細胞のイメージングおよび解析は ImageXpress Nano 装置と CellReporterXpress ソフトウェアを用いて実施しております。
画像 2. Calcein AM および MitoTracker Orange で染色した HeLa 細胞の 10x 画像と、ソフトウェア解析により生成されたマスク画像を示します。HeLa 細胞は抗がん化合物を 48 時間処理した後、核染色（Hoechst 33342）、生細胞染色（Calcein AM）、ミトコンドリア染色（MitoTracker Orange）を行いました。 細胞のイメージングは、ImageXpress Nano システムを用い、10x Plan Fluor 対物レンズにより DAPI、FITC、TRITC チャンネルで取得しております。左側の画像では、核（青）、Calcein AM による生細胞マーカー（緑）、ミトコンドリア（橙）が示されています。 画像解析は CellReporterXpress ソフトウェアを用い、Calcein AM 陽性細胞の定量に最適化された Cell Scoring モジュール（中央）と、MitoTracker Orange 陽性細胞の解析モジュール（右）により実施しました。得られた解析マスクは以下のとおりです： 淡青＝核、赤＝死細胞、緑＝生細胞、橙＝ミトコンドリア。
追加マーカーの評価を行うため、細胞を 4% formaldehyde 溶液で固定し、その後 PBS（Cellgro）で 2 回洗浄いたしました。固定後、細胞は permeabilization buffer（DPBS + 0.01% saponin + 1% FBS）を用いて 45 分間ブロッキングおよび透過化処理を行いました。
AlexaFluor® 488（AF488）標識 phalloidin は permeabilization buffer にて 1:50 に希釈し、37°C にて 2 時間細胞へ添加いたしました。染色後、細胞を PBS で洗浄し、AF488 により細胞骨格が染色された細胞を定量するよう最適化された Cell Scoring モジュールを用いてイメージングおよび解析を実施しました。
自動化イメージングおよび解析による表現型効果の定量化
典型的な自動化細胞ベースアッセイのワークフローは、細胞の播種、化合物処理、そして自動化イメージングで構成されます。取得した画像をソフトウェアで解析することで、化合物が細胞形態に及ぼす影響を特徴づける複数のリードアウトを得ることが可能となります。
多パラメーターアッセイでは、Calcein AM を用いて生細胞数の定義、細胞スプレッディングの評価、細胞形態の特徴づけを行うことができます。核染色は細胞数や増殖の評価、あるいはアポトーシス、核強度、核形状の特徴づけに使用されます。MitoTracker 染色はミトコンドリアの完全性や膜電位の評価に利用できます。
細胞は生細胞のままイメージングすることができ、その後固定して phalloidin などの追加試薬で染色することで、細胞骨格やその他のリードアウトに関する情報を取得することも可能です。
画像は ImageXpress Nano システムを用い、10x Plan Fluor 対物レンズと標準的な DAPI、FITC、TRITC フィルターセットにより取得いたしました。この対物レンズでは、未処理コントロールサンプルにおいて 1 視野あたり最大 2,400 細胞を正確に捕捉でき、統計的に十分な細胞数を確保することが可能です。CellReporterXpress ソフトウェアは、事前設定された解析モジュールを用いて画像取得と解析を同時に実行できるため、アッセイ結果の生成を効率化いたします。画像は取得中に Cell Scoring 解析モジュールを用いて解析され、Cell Scoring は細胞生存率、ミトコンドリアの健全性、細胞骨格の完全性の評価に最適化されています。また、核の解析には Cell Count 解析モジュールを使用し、核の特徴を評価できるよう最適化されています。これらのモジュールにより、総細胞数、マーカー陽性細胞数の定量、マーカーの強度および積分強度、総細胞面積および平均細胞面積、さらに核の平均面積や強度といった核の特徴解析を含む複数のリードアウトが得られました。
画像 3. 抗がん化合物で処理し、AF488-Phalloidin で染色した HeLa 細胞の代表的な画像と解析マスクを示します。画像は ImageXpress Nano システムを用い、10x Plan Fluor 対物レンズで取得いたしました。CellReporterXpress ソフトウェアでは、アクチンネットワークが保持された細胞を検出するよう最適化された Cell Scoring 解析モジュールを、画像取得と同時に実行しております。左側には 10x 画像の 25% を拡大した画像が示されており、青は Hoechst による核、橙は MitoTracker Orange によるミトコンドリア、緑は AlexaFluor® 488 Phalloidin によるアクチンを示します。右側には画像解析マスクが示されており、青は陽性核、赤は陰性核、緑は phalloidin で染色されたアクチンを表します。各化合物処理の濃度は、staurosporine が 0.123 μM、paclitaxel が 0.00152 μM、etoposide が 11.111 μM となります。
抗がん化合物の効果に対する多パラメーター表現型解析
評価した 5 種の既知の抗がん化合物は、それぞれ作用機序が異なり、mitomycin C（DNA 架橋形成剤）、etoposide（topoisomerase II 阻害剤）、doxorubicin（DNA インターカレーターおよび topoisomerase II 阻害剤）、paclitaxel（微小管阻害剤）、staurosporine（広範な protein kinase 阻害剤）となります。化合物の抗増殖作用は総細胞数に基づいて評価され、化合物濃度の上昇に伴い総細胞数は減少いたしました（画像 4）。Calcein AM 染色細胞の総数、割合、強度により判定した生存率も、化合物濃度の上昇に応じて減少いたしました（画像 4）。生細胞割合に対する EC50 値は、総細胞数の EC50 と比較して高濃度側へシフトしており（表 1）、化合物が低濃度では細胞増殖を阻害し、その後細胞死を誘導したことを示しています。Calcein AM 陽性細胞および phalloidin 陽性細胞の数と割合は類似しており、いずれのマーカーも細胞生存率の評価に使用できることが示唆されました（画像 5）。Calcein AM 染色強度の低下も HeLa 細胞の生存率の傾向と一致していました。MitoTracker 陽性細胞の数と割合、さらに EC50 は Calcein AM 陽性細胞の数と割合とよく相関しており、今回選択した化合物はミトコンドリアの完全性や膜電位に特異的な影響を及ぼす可能性が低いことが示唆されました。
画像 4.抗がん化合物処理が各種パラメーターに及ぼす影響を示す用量反応曲線です。HeLa 細胞は ImageXpress Nano システムを用いて生細胞および固定細胞の条件でイメージングされ、CellReporterXpress ソフトウェアで解析いたしました。Cell Scoring モジュールは、Calcein AM で染色された生細胞、MitoTracker Orange によりミトコンドリアが標識された細胞、そして AlexaFluor® 488 Phalloidin によりアクチンネットワークが保持された細胞を測定するよう最適化されています。4 パラメーターのロジスティック曲線でフィッティングしたプロットは、各抗がん化合物の作用を示しており、EC50 値は表 1 に記載されています。
| EC₅₀値（μM）± 標準偏差EC | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Cell Scoring解析結果 | Staurosporine | Mitomycin C | Paclitaxel | Etoposide | Doxorubicin |
| 総細胞数 | 0.009 ± 8.34 x 10-4 | 0.039 ± 0.007 | 5.15 x 10-4 ± 8.00 x 10-5 | 0.292 ± 0.030 | 0.007 ± 0.002 |
| 生細胞数 | 0.013 ± 0.002 | 0.056 ± 0.025 | 4.92 x 10-4 ± 5.95 x 10- | 0.311 ± 0.051 | 0.008 ± 0.002 |
| 生細胞割合（%） | 0.295 ± 0.009 | 12.43 ± 0.743 | 0.003 ± 6.19 x 10-4 | 88.47 ± 4.448 | 1.490 ± 0.037 |
| ミトコンドリア陽性細胞数 | 0.010 ± 9.93 x 10-4 | 0.059 ± 0.024 | 4.74 x 10-4 ± 4.57 x 10-5 | 0.291 ± 0.046 | 0.007 ± 0.001 |
| アクチン陽性細胞数 | 0.012 ± 0.001 | 0.063 ± 0.024 | 4.02 x 10-4 ± 4.26 x 10-5 | 0.358 ± 0.063 | 0.009 ± 0.003 |
| 生細胞総強度 | 0.014 ± 0.002 | 0.056 ± 0.025 | 2.82 x 10-4 ± 5.94 x 10-5 | 0.263 ± 0.057 | 0.005 ± 0.002 |
| アクチン陽性細胞強度 | 9.605 | 81.07 | 0.044 | 100.9 ± 17.63 | 26.87 |
| アクチン陽性細胞総面積 | 0.028 ± 0.003 | 2.437 ± 0.201 | 4.90 x 10-4 ± 2.29 x 10-5 | 6.628 ± 0.771 | 0.256 ± 0.037 |
| アクチン陽性細胞平均面積 | 0.707 ± 0.318 | 34.32 | 0.027 ± 0.014 | 0.222 ± 0.190 | 10.15 |
| 核平均強度 | 0.081 ± 0.019 | 4.902 ± 2.054 | 0.002 ± 4.47 x 10-4 | 16.53 ± 2.277 | 3.591 |
| 核平均面積 | 0.347 | 0.921 ± 0.449 | 0.805 ± 0.725 | 35.32 ± 50.46 | 1.45 ± 0.434 |
表 1 に示す EC₅₀ 値は、画像 4 および画像 5 に示された 4 パラメーター曲線フィットから算出されたものです。データは、Cell Scoring（Live Cell、Mitochondria、Actin）および Cell Count（Nuclei）の事前設定解析モジュールを用いて取得した測定値を示しています。標準誤差の値は、曲線フィットによって定義されたパラメーター推定値に基づくものです。標準誤差が未定義となっている場合は、曲線フィット自体は収束しているものの、パラメーター推定値の不確実性を算出できなかったことを示しています。
画像 5. 最適化された解析モジュールから得られた強度および面積のリードアウトを示します。Cell Scoring 解析モジュールは、生細胞およびアクチン陽性細胞に関連するパラメーターを解析するよう最適化されております。Cell Count 解析モジュールは、核の強度および面積を解析するよう最適化されています。Cell Scoring モジュールは ImageXpress Nano システムを用い、10x Plan Fluor 対物レンズによる画像取得と同時に実行されており、生細胞は固定前、アクチンは固定後の条件で解析されています。一方、Cell Count モジュールは画像取得後に追加解析として実行されました。これらのリードアウトから得られたデータには 4 パラメーター曲線フィットが適用されており、EC₅₀ 値は表 1 に記載されています。
選択した化合物の作用をさらに理解するために、追加の形態学的リードアウトを用いて異なる表現型変化の特徴づけを行いました（画像 5）。アポトーシスやストレスを受けた細胞は、スプレッディングやプレート表面への接着が変化する傾向があり、これは平均細胞面積や生細胞が占める総面積を測定することで評価できます。生細胞（Calcein AM 陽性細胞）や phalloidin 染色細胞が占める総面積は、抗がん剤濃度の上昇に伴い減少し、細胞の縮小を示していました（画像 5）。phalloidin 染色の細胞面積や強度は、細胞スプレッディング、細胞骨格の構造、細胞の脱着を評価するために利用できます。staurosporine の濃度が上昇すると、phalloidin 染色細胞の平均面積は減少し、細胞の縮小と脱着が示されました。一方、paclitaxel と etoposide では、平均細胞面積がわずかに増加し、これは観察された表現型変化と一致していました（画像 2、5）。mitomycin C と doxorubicin では、濃度の上昇に伴い平均細胞面積が増加しましたが、さらに濃度が上昇してアポトーシスが誘導されると平均細胞面積は減少しました（画像 5）。
興味深いことに、微小管の脱重合を阻害する paclitaxel では、濃度の上昇に伴いアクチン細胞骨格染色の強度が増加する現象が観察されました。同様の効果は etoposide 処理細胞でも認められました。最後に、核形状と核強度はアポトーシス細胞の判定に利用され、アポトーシス核は凝縮により強度が増加し面積が減少します。staurosporine、etoposide、paclitaxel、mitomycin では、化合物濃度の上昇に伴い平均核面積が減少し核強度が増加しており、細胞がアポトーシスを進行していることを示していました（画像 5）。例外は doxorubicin であり、最高濃度の 2 点では核強度が大きく減少していました。
結論
自動化された細胞イメージング手法は、化合物の作用を特徴づけ、細胞ベースアッセイにおける有効性を比較するうえで、抗がん剤の評価に非常に効率的なツールとなります。多様な細胞応答を調べることができる点は、化合物ごとの作用機序に関する重要な情報を提供いたします。ImageXpress Nano システムと CellReporterXpress ソフトウェアを組み合わせることで、さまざまな測定項目を解析し、複数のリードアウトを得て、評価対象化合物の表現型効果を特徴づけることが可能となります。
参考文献
- Swinney DC, Anthony J（2011）「新薬はどのように発見されたのか？」Nat Rev Drug Discov, 10 (7): 507–19.
- Kotz J（2012年4月）「フェノタイプスクリーニング：第二幕」Science-Business eXchange, 5 (15).
- Lee JA, Uhlik MT, Moxham CM, Tomandl D, Sall DJ（2012年5月）「現代のフェノタイプ創薬は有効なネオクラシック製薬戦略である」J. Med. Chem, 55 (10): 4527–38.
- Haney SA（編）（2008）『High content screening: science, techniques and applications』Wiley-Interscience（New York）.
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