Application Note 人工多能性幹細胞由来心筋細胞における
毒性化合物効果の表現型解析
- 自動画像処理による心毒性効果の評価
- 定量的画像解析を用いた細胞生存率と心毒性の判定
- 化合物の心毒性の濃度応答を評価する
PDF版（英語）
はじめに
オクサナ・シレンコ博士｜研究員｜モレキュラー・デバイス｜カリフォルニア州サニーベール
心毒性は、臨床試験中および市販後における薬剤の使用中止の主な原因である1。心血管疾患のかなりの割合が環境暴露に起因すると考えられているが、原因となる環境因子の同定はほとんど行われていない2。従って、in vitroスクリーニングのためのアッセイ開発の重要なターゲット領域には、潜在的な心毒性作用の検出が含まれる。
初代心筋細胞や心筋組織調製に代わるものとして、ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）由来のin vitroモデル系が、生理学的に適切で再現性の高い心毒性試験の選択肢として浮上してきた3, 4。心筋細胞は同期して拍動する単分子層を形成し、薬剤に関連した心生理学的表現型を確実に再現する。この表現型は、細胞内Ca2+フラックスの変化をモニターする高速カイネティック蛍光アッセイによって評価することができる5。拍動プロファイルの変化を評価することは、機能的効果を検出するために非常に重要であり、ハイコンテントイメージャーは、形態学的変化や化合物の細胞毒性効果をモニタリングするために不可欠な補完的アッセイである。
材料
- ImageXpress Nano自動イメージングシステムとCellReporterXpress自動画像取得・解析ソフトウェア（Molecular Devices社製）
- iCell ® 心筋細胞（Cellular Dynamics International社製）
- AFF88標識ファロイジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
- MitoTracker Orange（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
- Hoechst（サーモフィッシャーサイエンティフィック）
- 384ウェルマイクロプレート（コーニングライフサイエンス）
方法
本研究では、幹細胞由来の心筋細胞を用いたハイスループットスクリーニングアッセイにおけるImageXpress Nano自動イメージングシステムの効率性を評価した。iPSC由来心筋細胞は、心毒性に関連する医薬品および環境化学物質パネルの試験に使用した。ヒトiPSC由来心筋細胞（iCell®心筋細胞）、プレーティング培地、および維持培地は、Cellular Dynamics International社から提供された。細胞のプレーティングと維持は、製造元の推奨に従って行った6。セルは384ウェルプレートに8,000個/ウェルでゼラチンコートしたウェルにプレーティングした。心筋細胞単層の同期収縮は、培養5-7日後に明らかになった。
自動イメージングによる心毒性評価
心毒性を評価するために、細胞を様々な心毒性化合物で24時間処理した後、生存率を評価するためにCalcein AM、核を検出するためにHoechst 33342、インタクトなミトコンドリアを検出するためにMitoTrackerオレンジ色素で生きた細胞を染色した（それぞれ最終濃度0.5μM、2μM、1μM）。画像はImageXpress Nano自動イメージングシステムで取得し、CellReporterXpress™自動画像取得・解析ソフトウェアのCell Scoringまたは細胞生存率アプリケーションモジュールを用いて処理・定量化した。読み取り値には、Hoechst 33342の核数と強度、Calcein AM染色陽性の生細胞のパーセンテージと総面積、MitoTracker Orange色素陽性の細胞数が含まれた。
生細胞イメージング後、細胞を4％ホルムアルデヒドで固定し、細胞の細胞骨格の完全性を調べるためにAF-488ファロイジン（1：100希釈）で再染色した。画像はCell Scoringアルゴリズムを用いて解析し、心筋細胞の総面積および平均面積、ならびに無傷の細胞骨格を有する細胞の数および割合を定量化した。化合物は0.3、1.0、3.0、10、30、100μMで二重に試験した。DMSOコントロール（n=12）と未処理コントロール（n=4）が各プレートに含まれた。0.3%までのDMSOを用い、アッセイ内での溶媒効果を評価した。セルは37℃、5% CO2で24時間化合物に暴露された。384ウェルフォーマットでのプレーティング密度の最適化に関する詳細は、Grimmら4.
画像は10倍のPlan Fluor対物レンズを用いて取得した。384ウェルプレートの1ウェルにつき1枚の10倍画像を撮影した。10倍の対物レンズは、細胞骨格組織、細胞間円板などの細胞接合部、細胞内構造を識別するのに十分な解像度を提供し、同時にウェル内の比較的多くの細胞を捉えることができる。10倍の1視野（1.28 x 1.28 mm）で最大2,000個のセルを捉えることができ、これはウェル全体の面積（2.67 x 2.67 mm）の約1/4に相当する。図1は、コントロール細胞と化合物処理細胞の代表的な画像から得られた画像処理の例を示している。
図1. 心毒性の可視化のための心筋細胞の細胞骨格染色。iCell心筋細胞をプレーティングし、化合物で24時間処理した後、Hoechst（2μM）、MitoTracker Orange（1μM）の組み合わせで染色し、AF488標識ファロイジン（1:100）で固定・染色した。画像はImageXpress Nanoシステムで10x Plan Fluor対物レンズを用い、DAPI、TRITC、FITCチャンネルで撮影した。画像はCell Scoring解析アルゴリズムを用いて処理した。アクチン、Hoechst、MitoTracker Orangeの合成画像（左）および解析トレース（右）を、コントロールおよび選択化合物処理細胞について示す。指定化合物（スタウロスポリン、1μMおよびドキソルビシン、10μM）で処理した心筋細胞では、細胞骨格の破壊と細胞死が観察された。
定量的画像解析による細胞生存率と心毒性の判定
我々は、選択した化合物が生存細胞数（カルセインAM陽性またはAF-488陽性）に及ぼす影響を観察した（図2）。画像の定量的解析には、細胞骨格やミトコンドリアの完全性、接着細胞の領域を評価できるその他のパラメーターの導出も含まれた。特異性では、形態学的変化（セル面積の減少など）が観察された（デルタメトリン、アステミゾールなど）。スタウロスポリンでは、核面積の減少と核強度の増加が観察された（アポトーシスの徴候）。細胞毒性を示す化合物では、MitoTracker Orange染色の減少も観察された。化合物の毒性作用は、生存細胞数または総細胞面積の4パラメータカーブ処理フィットから得られたEC50値（カルセインAMまたはファロイジン陽性細胞の50％減少に対する化合物の濃度）によって評価した。他のパラメータは、高濃度では濃度依存的な変化を示したが、4パラメータカーブでは信頼できるフィット処理ができなかった。
図2. ファロイジンで染色した生存心筋細胞の用量反応曲線。細胞生存能は、化合物処理によって誘導された細胞骨格の完全性に対する細胞毒性効果を解析することによって決定した。CellReporterXpressソフトウェアのCell Scoring解析アルゴリズムを用いて、ファロイジン陽性染色（アクチンは緑色に染色）の生存細胞総数の観察を定量化した。濃度依存性応答曲線を4パラメータカーブフィット処理でプロットし、表1に示すEC50値を得た。
化合物心毒性の濃度反応評価
化合物効果のEC50値を表1に示す。試験した22種の化合物のうち、9種は細胞生存率を低下させ、総面積も低下させた。バリノマイシンとロテノンは、生細胞の総数で決定される毒性作用が最も強かった（EC50値は1μM未満）。メチル水銀とテトラエチルチウラムジスルフィドも強い毒性効果を示した（EC50値はそれぞれ3μMと15μM）。心毒性作用が知られているいくつかの薬剤（スタウロスポリン、スニチニブ、アステミゾール、ドキソルビシン、塩化ベルベリン）も、EC50値が1～15μMの範囲で、比較的顕著な毒性作用を示した。デルタメトリンとトルエンの影響は比較的軽微であった（EC50値は決定されなかった）。その他の試験化合物は細胞毒性作用を示さなかった。
|
化合物（EC 50 値、μM) |
陽性セル数 | 陽性セル総面積 |
|---|---|---|
| スタウロスポリン | 1.29
* |
2.83 |
| スニチニブ | 4.05 | 4.83 |
| 塩化ベルベリン | 7.08 | 3.96 |
| アステミゾール | 9.74 | 9.41 |
| ドキソルビシン | 14.02 | >30 |
| ドロペリドール |
効果なし ** |
効果なし |
| アミトリプチリン | 効果なし | 効果なし |
| パクリタキセル | 効果なし | 効果なし |
| イマチニブ | 効果なし | 効果なし |
| ブスルファン | 効果なし | 効果なし |
| バリノマイシン | 0.057 | 0.053 |
| ロテノン | 0.111 | 0.106 |
| メチル水銀 | 3.08 | 2.86 |
| テトラエチルチウラムジスルフィド | 15.2 | 12.8 |
| デルタメトリン |
>100 *** |
128 |
| トルエン | >100 | >100 |
| テトラブチルフェニル | 効果なし | 効果なし |
| リン酸ジフェニル | 効果なし | 効果なし |
| サリドマイド | 効果なし | 効果なし |
| トリクレジルホスフェート | 効果なし | 効果なし |
| トリフェニルホスフェート | 効果なし | 効果なし |
| サッカリン | 効果なし | 効果なし |
| ロイシン | 効果なし | 効果なし |
* 100以上」は、試験した最高濃度（100μM）で毒性作用（陽性細胞数または総細胞面積の減少）が観察されたが、EC50値は決定されなかったことを意味する。
表1. 試験化合物について測定した細胞毒性作用のEC50値。EC50値は、4パラメータカーブフィット処理でプロットした用量依存性応答曲線からHillモデルに基づいて作成した。曲線は、ファロイジン陽性細胞（生存細胞）の総数と総面積について作成した。
概要
このアッセイは、複数の化学物質の心毒性をハイスループットでスクリーニングするためのImageXpress NanoシステムとCellReporterXpressソフトウェアの効率性と信頼性を実証するものである。このスクリーニング・ツールは、薬剤開発の初期段階での心毒性薬剤の同定を可能にし、ヒトにおける潜在的な薬剤の心毒性作用を試験するための信頼性の高いツールを提供する。
参考文献
- Berridge BR, Hoffmann P, Turk JR, Sellke F, Gintant G, Hirkaler G, Dreher K, Schultze AE, Walker D, Edmunds N, Halpern W, Falls J, Sanders M, Pettit SD. 非臨床試験におけるin vivo心血管系リスク評価の統合化とトランスレーショナル： ギャップと機会。(2013) Regul Toxicol Pharmacol 65:38-46
- Pruss-Ustun A, Corvalan C. 健康的な環境による疾病予防： 疾病の環境負荷の推定に向けて。(2006). スイス、ジュネーブ：世界保健機関
- Grimm FA, Iwata Y, Sirenko O, Bittner M, Rusyn I. 人工多能性幹細胞由来の心筋細胞および肝細胞における毒性スクリーニングのためのハイコンテントアッセイマルチプレックス。(2015) Assay Drug Dev Technol 13:529-546
- Guo L, Abrams RM, Babiarz JE, Cohen JD, Kameoka S, Sanders MJ, Chiao E, Kolaja KL. ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞を用いた薬物誘発性催不整脈リスクの推定。(2011) Toxicol Sci 123:281-289
- シレンコ O、クロムウェル EF、クリッテンデン C、ウィグナル JA、ライト FA、ルシン I. ヒト人工多能性幹細胞における拍動パラメータの評価により、心毒性の定量的 in vitro スクリーニングが可能となった。(2013b) Toxicol Appl Pharmacol 273:500-507
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