Application Note ASBC認定ELISA法を用いた
ビール中のグルテン定量

Cathy Olsen博士｜シニアアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Joyce Itatani ｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラーデバイス

はじめに

ビール中のグルテン定量

近年、セリアック病の有病率が増加しており、食品や飲料中のグルテン量を監視することは、グルテンを避けたい人々にとってますます重要になっています。FDAガイドラインでは、「グルテンフリー」「グルテンなし」「グルテンを含まない」などの表示をする食品は、グルテン含有量が20 ppm（百万分率）未満である必要があります。これは現在受け入れられている試験法における定量下限（LOQ）です。

グルテンは小麦、ライ麦、大麦、およびそれらの交雑種に自然に含まれています。グルテンは、これらの穀物に含まれるプロラミンとグルテリンタンパク質の混合物です。食品加工や消化の過程で、プロラミンは分解され、小さなペプチド断片となりますが、これらはセリアック患者にとって依然として危険です。サンドイッチELISAでは、2つのエピトープが必要なため、これらの小さなペプチド断片は検出できません。しかし、RIDASCREEN® Gliadin競合ELISAは、小麦、ライ麦、大麦の加水分解物という新しい標準物質を使用して、これらの断片を検出できます（図1）。このキットで使用されるR5抗体は、小麦のグリアジンやライ麦・大麦のプロラミンに由来する潜在的に有害なペプチド配列を認識します（Kahlenberg et al., 2005）。

さまざまなサンプルタイプでグルテン含有量を測定する製品は多数ありますが、すべてが定量的であるわけではなく、すべてが認定試験法であるわけでもありません。RIDASCREEN® Gliadin競合ELISAは、AACC International認定法（38-55.01）であり、AOAC認定の公式分析法（First Action OMA 2015.05）です。この方法は、ビール、デンプンシロップ、サワードウでの使用について、18の研究所による国際的な試験で評価されています。さらに、American Society of Brewing Chemists（ASBC）による第2の国際共同試験では、RIDASCREEN® Gliadin競合ELISAが15の研究所で5種類のビールに対して評価され、このELISAは現在ASBC認定国際法（Beer-49）となっています。

ここでは、市販の6種類のビールに含まれるグリアジン量をRIDASCREEN Gliadin競合ELISAで測定しました。試験したビールには、グルテンフリー、低グルテン、ヴァイツェンビア（小麦ビール）などが含まれます。ELISAはSpectraMax® ABS Plusマイクロプレートリーダーで読み取り、結果はSoftMax® Proソフトウェアで解析しました。定量結果により、グルテンフリーおよび低グルテンビールのグルテン量が20 ppm未満であることが確認されました。

資料

• RIDASCREEN Gliadin Competitive
• 市販ビール
  • 低減グルテン
  • グルテンフリー
  • ヴァイツェンビール
  • ブロンド・エール
  • アメリカン・ポーター
  • インディア・ペールエール
• 冷水魚皮ゼラチン40%（Electron Microscopy Sciences）
• Multi-Wash+™ マイクロプレートウォッシャー (モレキュラーデバイス)
• SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

試薬の調製

キットに含まれるすべての試薬は、製品インサートに記載された手順に従って調製しました。

• バッファー（サンプル希釈液）は、脱イオン水で1:5に希釈しました。
• 洗浄バッファーは、結晶を溶解するために37°Cのウォーターバスで加温し、その後脱イオン水で1:10に希釈しました。
• 抗体酵素コンジュゲートは、ピペッティング前に軽く振り、その後脱イオン水で1:11に希釈しました。アッセイに必要な量のみを希釈しました。
• 基質/クロモゲン（Red Chromogen Pro）および停止液は、使用可能な状態で供給されました。

ビールサンプルの前処理

各ビール1 mLを、10%冷水魚皮ゼラチンを含む60%エタノール溶液9 mLと混合し、15 mLコニカルチューブに入れました。サンプルをボルテックスで十分に混合し、ロータリーで10分間攪拌しました。その後、サンプルを2500 rpmで10分間遠心しました。得られた上清はアッセイに使用でき、暗所で室温保存すれば最大4週間保管可能です。アッセイ前に、上清を希釈サンプル希釈液（バッファー）で1:50に希釈しました。

ELISA

マイクロウェルストリップホルダーに3本のストリップウェルを配置し、未使用ウェルは乾燥剤入りのアルミパウチに保管しました。

各グリアジン標準液（0、10、30、90、270 ng/mL）または調製済みサンプル50 μLを複製ウェルに添加しました。プレートブランク用の複製ウェルも設定しました（標準液やサンプルは添加しない）。各ウェルに希釈した抗体酵素コンジュゲート50 μLを添加し、プレートを軽く振って手動で混合しました。プレートを室温で30分間インキュベートしました。次に、MultiWash+マイクロプレートウォッシャーを使用して、希釈洗浄バッファー250 μLで3回洗浄しました。

各ウェルに基質/クロモゲン100 μLを添加し、プレートブランクウェルも含めて軽く振って混合し、暗所で室温で10分間インキュベートしました。その後、各ウェルに停止液100 μLを添加し、軽く振って混合しました。10分以内に、SpectraMax ABS Plusプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定しました。SoftMax ProソフトウェアのプロトコールライブラリにあるELISAプロトコールを使用しました。

SoftMax Proソフトウェアで半対数曲線フィットを用いて標準曲線を作成し、サンプル濃度を標準曲線から算出しました。

結果

グリアジン標準曲線（図2）から、ソフトウェアによりグリアジン濃度が自動的に補間されました。濃度（ng/mL）は希釈係数（500）を掛けて元のビールサンプル中の値に調整し、グリアジン（ng/mL）をグリアジン（ppm）に変換するために1000で割りました。グリアジンをグルテンに変換するために、Codex Alimentariusの定義に従って係数2を使用し、最終的に結果はグルテンppmとして表されました（図3）。これらの計算はSoftMax Proソフトウェアのプロトコール内の「Unknowns」グループテーブルに追加されました。

図3. SoftMax Proソフトウェアで表示されたグループテーブル ビールサンプル中のグリアジン濃度は標準曲線から補間され、希釈係数を掛けて調整濃度（ng/mL）を算出しました。グリアジンppmおよびグルテンppmは調整濃度から計算されました。

グルテンフリーまたは低グルテンと表示されたビールは、計算されたグルテン濃度が20 ppm未満であり、FDAガイドラインを満たしていました。グルテンフリービールの一部のサンプル複製では、OD値が最も低いグリアジン標準値を下回り、この複製は範囲外として「R」でフラグ付けされました（図3）。グルテン含有量が高いと予想されたヴァイツェンビアは、270 ng/mL標準を超えるグリアジン値を示し、グループテーブルで範囲外としてフラグ付けされました。正確なグルテン定量を得るには、このビールをさらに希釈する必要があります。他のビールは14～118 ppmの範囲で、インディアペールエールは20 ppm未満で「グルテンフリー」レベルに該当しました。

ブロンドエールは87 ppmのグルテンを含み、Codex Alimentarius基準では「超低グルテン」と表示できます。

SpectraMaxマルチモードプレートリーダーでも同様の結果が得られました（結果は非表示）。

結論

RIDASCREEN Gliadin競合ELISAは、ビール中のグルテン検出における定量的ソリューションを提供します。MultiWash+ウォッシャーを使用して洗浄工程を自動化することで、アッセイに必要な手作業時間を短縮できます。SpectraMax ABS Plusプレートリーダーでの吸光度検出と、SoftMax Proソフトウェアによる結果計算により、ELISAワークフローがさらに簡素化され、注意が必要な結果をフラグ付けできます。サンプルから結果まで、グルテン含有量を信頼性高く決定するために必要な時間は約1時間です。

参考文献

Kahlenberg F., Sanchez D., Lachmann I., Tuckova L., Tlaskalova H., Mendez E., Mothes T. (2005). Monoclonal antibody R5 for detection of putatively coeliac-toxic gliadin peptides. European Food Research and Technology 222(1-2), 78-82.