Application Note IL-8定量を効率化する
SpectraMax ABS PlusとELISA

  • AbcamのSimpleStep ELISAキットを使用して、感度と再現性を損なうことなくELISA実験時間を260分から90分に短縮します
  • SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーで、ELISAプレート全体を最短5秒で測定します
  • SoftMax Proソフトウェアで、サンプル濃度を自動計算し、結果をプロットします
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はじめに

Cathy Olsen | Sr. Applications Scientist | モレキュラーデバイス

THP-1は急性単球性白血病患者由来のヒト単球系細胞株で、in vitroでマクロファージ機能を研究する際によく使用されます。THP-1細胞は通常、浮遊状態で培養されますが、phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）で処理するとマクロファージに分化し、接着性を示します。また、インターロイキン-8（IL-8）を含むサイトカインの分泌を開始します。IL-8はさまざまな細胞タイプから分泌され、急性炎症反応の調節に関与します。

酵素免疫測定法（ELISA）は、IL-8のような分析対象を96ウェルマイクロプレートフォーマットで定量するためによく使用されます。一般的なELISAは4時間以上かかりますが、Abcam社のSimpleStep ELISA®キットを使用すると、わずか90分でELISAを処理でき、感度と再現性を損なうことなく、所要時間を約3分の1に短縮できます（図1）。ここでは、Human IL-8 SimpleStep ELISAを実施し、SoftMax® Proソフトウェアの便利なプリセットプロトコールを使用してSpectraMax® ABS Plusマイクロプレートリーダーで結果を検出する方法をご紹介します。

図1. SimpleStep ELISAキットと従来のELISAワークフローの比較 AbcamのSimpleStep ELISAキットは、簡略化されたプロトコールにより90分で結果を提供します。従来のELISAとは異なり、SimpleStep ELISAキットは1回のインキュベーションと1回の洗浄ステップのみを必要とし、アッセイ時間を約3分の1に短縮します。

材料

  • ヒト IL-8 SimpleStep ELISA キット（Abcam）
  • THP-1ヒト末梢血単球（ATCC）
  • THP-1培地
  • RPMI-1640培地 (ATCC)
  • ベンチマークウシ胎児血清 (Gemini)
  • 2-メルカプトエタノール (Sigma)
  • ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) (ThermoFisher)
  • SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

方法

THP-1細胞の準備

未分化のTHP-1浮遊細胞を各ウェルに20,000個ずつ96ウェルマイクロプレートに播種しました。その後、THP-1細胞を培養液で希釈した2.5 ng/µLのPMAまたはDMSO（陰性コントロール）で処理しました。処理後、細胞を37°Cのインキュベーターに48時間置きました。細胞上清は回収し、ELISAを実施するまで-80°Cで保存しました。

ELISA

ELISA当日、サンプル上清を解凍し、デブリを除去するためにマイクロ遠心機で2,000 × gで10分間遠心し、提供されたサンプル希釈液で1:5、1:10、1:50に希釈しました。Human IL-8 SimpleStep ELISAの試薬と標準品はキットのプロトコールブックレットに従って準備しました。サンプルと標準品を提供されたマイクロプレートに添加し、抗体カクテルをウェルに加え、プレートを密封して室温で1時間プレートシェーカー上でインキュベートしました。プレートのウェルはWash Buffer PTで3回洗浄しました。TMB基質を各ウェルに添加し、暗所で15分間プレートシェーカー上でインキュベートしました。Stop Solutionを各ウェルに添加し、SoftMax Proソフトウェアのプリセットプロトコールを使用してSpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度（OD）を測定しました（ワークフローは図1参照）。

結果

SoftMax Proソフトウェアの「HRP and TMB」プロトコールでr² = 1.000の線形IL-8標準曲線が生成されました（図2）。標準曲線から、ソフトウェアはDMSO処理陰性コントロール細胞およびPMA処理細胞由来サンプルのIL-8濃度を補間しました。希釈が不十分なサンプルは、プリセットプロトコールのグループテーブルで標準曲線の範囲外（「R」）としてフラグ付けされました（図3）。PMA処理細胞のIL-8濃度は3,400 pg/mLと算出され、DMSO処理陰性コントロールで検出された63 pg/mLよりも55倍高い値でした（図4）。

図2. ELISA標準曲線 IL-8標準品はサンプル希釈液で希釈し、Human IL-8 SimpleStep ELISAキットで測定しました。SoftMax Proソフトウェアで標準品に線形フィットを適用し、生成された標準曲線は優れた線形性を示しました（r² = 1.000）。

図3. 計算されたサンプル濃度を表示するグループテーブル PMA処理細胞のIL-8濃度は、プリセットSoftMax Proプロトコールによって標準曲線から自動補間され、グループテーブルに表示されました。「R」列に「R」が表示されたサンプルは、標準曲線の範囲外の濃度が計算されたことを示し、この場合はサンプルをさらに希釈する必要があります。

図4. 未分化（DMSOコントロール）および分化（2.5 ng/µL PMA）THP-1細胞で測定されたIL-8濃度 2.5 ng/µL PMA処理THP-1細胞は3,400 pg/mLのIL-8を産生し、未分化THP-1細胞が産生した62 pg/mLと比較して55倍の増加を示しました。

結論

SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーは、AbcamのHuman IL-8 SimpleStep ELISAキットを用いて迅速かつ高感度なIL-8検出を提供します。SimpleStep ELISAの独自の抗体結合技術により、THP-1細胞上清中のIL-8をわずか90分で定量でき、従来のELISAに必要な時間の約3分の1で、感度と再現性を損なうことなく測定できます。

プレートリーダーの8チャンネル検出器は、96ウェルELISAプレート全体を最短5秒で読み取ることができます。SoftMax Proソフトウェアのプリセットプロトコールは、標準曲線を自動でプロットし、サンプル濃度を計算し、陰性コントロールと処理細胞の結果をプロットできるため、出版品質の結果を得るまでの時間をさらに短縮します。

SimpleStep ELISA® はAbcam plcの登録商標です。

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