Application Note SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルにより、
データ収集・解析を簡素化
- SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットを用いたdsDNAサンプルの定量
- 一本鎖DNAやRNAよりもdsDNAに対して高い選択性
- 3種類のキットで幅広い濃度範囲に対応
- SpectraMaxマイクロプレートリーダーに最適化
PDF版（英語）
はじめに
DNAはほぼすべての生きたセルに存在し、生命の分子命令を封じ込めます。次世代シーケンシングやジェノタイピングなどの分子生物学研究において、DNAの確実で正確な定量は不可欠なステップです。二本鎖DNA（dsDNA）の定量に利用可能な様々な方法の中で、マイクロプレートリーダーを用いたフルオロメトリックアッセイは、感度の大幅な向上、一本鎖DNA（ssDNA）やRNAに対するdsDNAの高い選択性、DNA精製プロセスで一般的に見られるコンタミネーションに対する耐性の向上など、いくつかの重要な利点を提供するため、ますます人気が高まっています。マイクロプレートフォーマットはまた、ハイスループットとサンプル量の削減を可能にします。
検査サンプルの種類によってDNAの封じ込め濃度が異なるため、必要な感度と検出範囲を持つ適切な蛍光試薬を選抜することが重要です。このアプリケーションノートでは、ウェルあたり5ピコグラム（pg）から2000ナノグラム（ng）までのDNAサンプルの正確な定量にSpectraMax® Quant™ dsDNAアッセイキットを使用した例を示します。SpectraMax®蛍光マイクロプレートリーダーを使用してデータを取得し、SoftMax® Proソフトウェアの設定済みプロトコルを使用して迅速に解析します。
材料と方法
SpectraMax Quant dsDNAアッセイキット
SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットは3つの製品で構成され、各製品は特異性範囲のDNA濃度用に設計され、SpectraMaxマイクロプレートリーダーなどの蛍光マイクロプレートリーダーでの使用に最適化されています（表1）。バックグラウン ド蛍光をさらに低減し、アッセイのダイナミックレンジを広げるために、エンハンサーがキットに含まれています。製品構成の詳細はwww.moleculardevices.com。
| アッセイキット |
直線検出範囲 （ウェルあたり） |
蛍光リーダー設定 （Excitation/Emission） |
|---|---|---|
| SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ Pico dsDNAアッセイキット | 0.005 ng – 3 ng | 468 nm/507 nm |
| SpectraMax® Quant™ AccuClear™ Nano dsDNAアッセイキット | 0.03 ng – 250 ng | 468 nm/507 nm |
| SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ HiRange dsDNAアッセイキット | 2 ng – 2,000 ng | 350 nm/460 nm |
表1. SpectraMax Quant dsDNAアッセイキット。
SpectraMax i3xマイクロプレートリーダーおよびSoftMax Proソフトウェアのプロトコル
各アッセイキットには、SoftMax Proソフトウェアにあらかじめ設定されたプロトコルが含まれており、簡便なワークフローでデータの収集・解析を行うことができます。プロトコールは、SoftMax Proソフトウェアのプロトコル共有ウェブサイト（www.softmaxpro.org）からも入手できます。設定済みプロトコルを見つけるには、ソフトウェアを起動し、"Protocol "タブを選択します。Protocol Managerを開き、"Protocol Library "を選択します。Nucleic Acids（核酸）」フォルダまでスクロールダウンし、使用しているDNA定量キットに適合する設定済みプロトコルの名前をクリックして開きます。
実験プロトコル
各キットを室温に戻しました。SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットそれぞれの標準曲線を、各キットに付属の標準物質を用いて作成しました。各キットの作業溶液を調製するための一般的なプロトコールは類似していますが、バッファー、染料、エンハンサーは異なります。バッファーと作業溶液濃度の詳細については表 2 を参照。dsDNA標準試料10µLを黒色96ウェルプレート（Greiner cat.#655076）のウェルにプレーティングし、続いて200µLの作業溶液を加えました。各標準曲線用に1枚のプレートを作成しました。さらに、dsDNA に対する色素特異性を比較するため、各キットに同じ濃度の ssDNA と RNA をプレーティングしました。サンプルプレートは蓋をして5分間振とうして混合し、蛍光シグナルをマイクロプレートリーダーで検出しました。SoftMax Proソフトウェアの各キットに特異的に設定されたプロトコルを用いて、データを取得し、自動的に解析しました。ワークフローを図1に示します。詳細な手順は各製品の添付文書に記載されています。未知のサンプルを検査する場合、濃度は標準曲線から補間され、"Samples "グループの表の "Mean Result "列に報告されます。
| アッセイキット | 緩衝液 | 色素 | エンハンサー |
|---|---|---|---|
| SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ Pico dsDNAアッセイキット | 脱イオン水で1:20に希釈 | AccuBlue Pico色素をAccuBlue Pico Bufferで1:400に希釈 | 色素と同じチューブで1:100に希釈 |
| SpectraMax® Quant™ AccuClear™ Nano dsDNAアッセイキット | 脱イオン水で1:20に希釈 | AccuClear NanodyeをAccuClearNano Bufferで1:100に希釈 | NA |
| SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ HiRange dsDNAアッセイキット | 希釈しない | AccuBlue HiRangeyeをAccuBlue HiRange Bufferで1:100に希釈 | 色素と同じチューブで1:100に希釈 |
表2. SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットの作業溶液成分。
図1. SpectraMax Quant dsDNA定量アッセイキットのワークフロー。
結果
SoftMax Proソフトウェアは、読み取り後のデータを自動的に解析し、プロットします。デフォルトでは、標準曲線は線形カーブフィット処理でプロットされますが、グラフセクションのドロップダウンカーブフィットメニューでlog-logカーブフィットも利用できます。3種類のSpectraMax Quant dsDNAアッセイキットそれぞれの標準曲線を図2に示します。それぞれのR2値は0.999でした。標準曲線中のdsDNAからの蛍光シグナルを、同濃度の一本鎖DNAおよびRNAからの蛍光と比較しました。3つのキットはすべてdsDNAに選択的です。結果を図3に示します。
図2. 標準曲線の比較。SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットの標準曲線を示します。(A) SpectraMax Quant AccuBlue Picoアッセイ；(B) SpectraMax Quant AccuClear Nanoアッセイ；(C) SpectraMax Quant AccuBlue HiRangeアッセイ。各曲線のR2 = 0.999。
図3. SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットの選択性。蛍光色素は、ssDNA（紫）およびRNA（青）よりもdsDNA（赤）に有利に結合します。(A) AccuBlue Picoキット、(B) AccuClear Nanoキット、(C) AccuBlue HiRangeキット。
結論
SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットは、幅広い濃度のdsDNAを高い選択性で正確に定量します。SpectraMaxリーダーおよびSoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルと併用することで、これらのキットは、未知のdsDNAサンプルの濃度を測定するためのシンプルなワークフローと正確な結果を可能にします。
SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットについてさらに詳しく>
PDF版（英語）