Application Note SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットを用いた
二本鎖DNA（dsDNA）サンプルの定量
- 二本鎖DNA（dsDNA）に対して高い選択性
- 3種類のキットで広範な濃度範囲に対応
- SpectraMaxマイクロプレートリーダーに最適化
- SoftMax Proソフトウェアにプリセットされたプロトコールで、データ取得と解析が簡便
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はじめに
DNAは、ほぼすべての生細胞に存在し、生命の分子的な設計図を担っています。次世代シーケンシングやジェノタイピングなどの分子生物学研究において、DNAを信頼性高く正確に定量することは、極めて重要なステップです。二本鎖DNA（dsDNA）の定量にはさまざまな方法がありますが、マイクロプレートリーダーを用いた蛍光アッセイは、感度の大幅な向上、一本鎖DNA（ssDNA）やRNAに対する高い選択性、DNA精製過程で一般的に混入する不純物に対する耐性の向上など、複数の利点から広く利用されています。さらに、マイクロプレートフォーマットは、高スループットと少量サンプルでの測定を可能にします。/p>
試料の種類によってDNA濃度が異なるため、目的に応じた感度と検出範囲を持つ蛍光試薬の選定が重要です。本アプリケーションノートでは、SpectraMax Quant AccuClear Nano dsDNA アッセイキット、SpectraMax Quant AccuBlue HiRange dsDNA アッセイキット、およびSpectraMax Quant AccuBlue Pico dsDNA アッセイキットを用いて、1ウェルあたり5ピコグラム（pg）〜2000ナノグラム（ng）のDNAサンプルを高精度に定量する方法をご紹介します。データはSpectraMax 蛍光マイクロプレートリーダーで取得し、SoftMax Pro ソフトウェアにプリセットされたプロトコールを用いて迅速に解析されます。
材料と方法
SpectraMax Quant dsDNA アッセイキット
SpectraMax Quant dsDNA アッセイキットは、DNA濃度の異なるサンプルに対応する3種類の製品で構成されており、SpectraMax 蛍光マイクロプレートリーダーなどの蛍光マイクロプレートリーダーでの使用に最適化されています（表1参照）。一部のキットには、バックグラウンド蛍光を低減し、アッセイのダイナミックレンジを拡張するためのエンハンサーが含まれています。 製品構成の詳細については、以下をご参照ください：SpectraMax Quant dsDNAアッセイキット
| アッセイキット |
直線検出範囲 （ウェルあたり） |
蛍光リーダー設定 （Excitation/Emission） |
|---|---|---|
| SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ Pico dsDNAアッセイキット | 0.005 ng – 3 ng | 468 nm/507 nm |
| SpectraMax® Quant™ AccuClear™ Nano dsDNAアッセイキット | 0.03 ng – 250 ng | 468 nm/507 nm |
| SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ HiRange dsDNAアッセイキット | 2 ng – 2,000 ng | 350 nm/460 nm |
表1. SpectraMax Quant dsDNAアッセイキット。
SpectraMax i3xマイクロプレートリーダーおよびSoftMax Proソフトウェアのプロトコル
各アッセイキットには、SoftMax Proソフトウェアにあらかじめ設定されたプロトコールが含まれており、簡便なワークフローでデータの収集・解析を行うことができます。プロトコールは、SoftMax Proソフトウェアのプロトコール共有ウェブサイトからも入手できます。設定済みプロトコールを見つけるには、ソフトウェアを起動し、"Protocol "タブを選択します。Protocol Managerを開き、"Protocol Library "を選択します。Nucleic Acids（核酸）」フォルダまでスクロールダウンし、使用しているDNA定量キットに適合する設定済みプロトコールの名前をクリックして開きます。
実験プロトコール
キット構成品は室温に戻してから使用しました。各SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットについて、付属のスタンダードを用いて標準曲線を作成しました。各キットのワーキング溶液の調製手順は概ね共通していますが、使用されるバッファー、色素、増感剤は異なります。バッファーおよびワーキング溶液の濃度に関する詳細は、表2をご参照ください。ブラックの96ウェルプレート（Greiner）の各ウェルに、dsDNAスタンダードサンプル10 µLを分注し、続いてワーキング溶液200 µLを加えました。標準曲線ごとに1枚のプレートを作成しました。加えて、各キットにおいて、色素のdsDNA特異性を比較するために、同濃度のssDNAおよびRNAも同様にプレートに分注しました。プレートはカバーをして5分間シェイクし、蛍光シグナルをマイクロプレートリーダーで検出しました。データはSoftMax Proソフトウェアに搭載された各キット専用のプロトコールを用いて自動的に取得・解析されました。ワークフローの概要は図1に示されています。詳細な手順については、各製品の添付文書をご参照ください。未知試料を測定する際には、標準曲線から濃度を補間し、「Samples」グループテーブルの「Mean Result」列に結果が表示されます。
| アッセイキット | 緩衝液 | 色素 | エンハンサー |
|---|---|---|---|
| SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ Pico dsDNAアッセイキット | 脱イオン水で1:20に希釈 | AccuBlue Pico色素をAccuBlue Pico Bufferで1:400に希釈 | 色素と同じチューブで1:100に希釈 |
| SpectraMax® Quant™ AccuClear™ Nano dsDNAアッセイキット | 脱イオン水で1:20に希釈 | AccuClear NanodyeをAccuClearNano Bufferで1:100に希釈 | NA |
| SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ HiRange dsDNAアッセイキット | 希釈しない | AccuBlue HiRangeyeをAccuBlue HiRange Bufferで1:100に希釈 | 色素と同じチューブで1:100に希釈 |
表2. SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットの作業溶液成分。
図1. SpectraMax Quant dsDNA定量アッセイキットのワークフロー
結果
SoftMax Proソフトウェアは、測定後にデータを自動的に解析し、グラフを作成します。標準では、標準曲線はリニアフィットで描画されますが、グラフセクションの［Curve Fit］メニューからログ-ログフィットへの変更も可能です。3種類のSpectraMax Quant dsDNAアッセイキットそれぞれの標準曲線は図2に示されており、いずれもR²値は0.999でした。標準曲線におけるdsDNA由来の蛍光シグナルは、同濃度の一本鎖DNA（ssDNA）およびRNAからの蛍光と比較されました。その結果、3種類すべてのキットがdsDNAに対して選択性を有することが確認されました。結果は図3に示されています。
図2. 標準曲線の比較。SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットの標準曲線を示しています。(A) SpectraMax Quant AccuBlue Picoアッセイ。(B) SpectraMax Quant AccuClear Nanoアッセイ。(C) SpectraMax Quant AccuBlue HiRangeアッセイ。各曲線のR²値は0.999です。
図3. SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットの選択性。蛍光色素は、ssDNA（紫）やRNA（青）よりもdsDNA（赤）に優先的に結合します。(A) AccuBlue Picoキット。(B) AccuClear Nanoキット。(C) AccuBlue HiRangeキット
結論
SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットは、広範な濃度範囲のdsDNAを高い選択性で正確に定量することができます。SpectraMaxプレートリーダーおよびSoftMax Proソフトウェアに搭載された事前設定済みプロトコールと組み合わせて使用することで、ワークフローの簡素化と未知のdsDNAサンプルの正確な濃度測定が可能になります。
SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットについてさらに詳しく>
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