Application Note 2Dおよび3D乳がんモデルシステムにおいて、
発光性バイアビリティアッセイで薬物反応を迅速に評価する

はじめに

長年にわたり、平坦な培養面上に単層で増殖させた細胞を含む二次元（2D）細胞培養は、疾患のメカニズムを調べたり、潜在的な新薬の効果を評価したりするのに便利なシステムとして役立ってきた。二次元で培養された癌細胞株は、長い間、由来する癌の実験的代用として役立ってきた。近年、他の細胞種とともに、がん細胞を多層構造を形成できる三次元（3D）フォーマットで培養することで、より生物学的に適切と考えられるがん研究の新しいモデルが可能になりつつある。

複雑な3D細胞モデルに対する薬剤候補の効果に関する詳細な情報を得るためには、イメージングやハイコンテンツ解析が必要とされることが多いが、全体的な細胞生存率のような単一のパラメーターを評価できる、わかりやすい細胞ベースのアッセイも必要とされている。アデノシン三リン酸（ATP）アッセイは、細胞生存率に対する治療効果を評価するために広く用いられている方法である。代謝的に活性な細胞はエネルギー源としてATPを使用し、傷害を受けたり栄養素が枯渇したりすると、細胞質のATPが急速に減少する傾向がある。ATPを測定するためのアッセイは通常、ホタルルシフェラーゼ反応に基づく発光リードアウトを持ち、これは生存細胞から供給されるATPを必要とする（図1）。ATPアッセイからの迅速な読み出しは、大規模な化合物セットを迅速にスクリーニングし、細胞生存率に大きく影響するサブセットを同定するのに利用できる。その後、この減少したセットを、より表現型の詳細を提供する、より労力のかかる実験を含む、より焦点の絞られたフォローアップ研究に適用することができる。

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ここでは、CellTiter-Glo® 3D Cell Viability assay（プロメガ社製）を用いて測定した、2Dおよび3D細胞培養における細胞生存率の小規模研究を紹介する。エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）陽性の一般的な乳がん細胞株であるMCF-7と、トリプルネガティブ（ER-、PR-、HER2-陰性）サブタイプの準形成乳がんを代表する患者由来の腫瘍摘出細胞であるTU-BcX-4ICである。アッセイ検出には、低バックグラウンド発光と高感度を実現する超低温PMTを搭載したSpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Readerを使用した。すべてのデータはSoftMax Pro Softwareで解析され、カーブフィッティングやIC50の計算が行われた。

材料

• CellTiter-Glo 3D 細胞生存率アッセイ（Promega cat.）
• MCF7乳がん細胞株（ATCC cat.）
• TU-BcX-4IC患者由来原発性トリプルネガティブ乳がん細胞（Tulane大学M. Burow研究室より提供）
• MCF7用増殖培地：MEM（Corning cat. #10-010-CV）＋10％ウシ胎児血清（FBS、Avantor Seradigm cat. #1500-500）＋1％抗生物質-抗真菌剤（Gibco 15240-062）＋0.01％mg/mLヒト組換えインスリン（Gibco cat. #12585-014）
• TU-BcX-4IC用増殖培地： DMEM（Corning cat.#15-017-CV）+10%ウシ胎児血清（FBS、Avantor Seradigm cat.#1500-500）+1%抗生物質-抗真菌剤（Gibco cat.#15240-062）+1%NEAA（Gibco cat.#11140-050）+0.01%mg/mLインスリン、ヒト遺伝子組換え（Gibco cat.#12585-014）
• 384ウェルPrimeSurface 3D白色培養プレート、超低吸着、U底マイクロプレート（Sbio社製 cat.）
• 384ウェル白色組織培養処理ソリッドボトムマイクロプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製 cat.）
• 試験化合物：

• ボルテゾミブ (Tocris 社: #7282)
• イブルチニブ（Tocris cat.）
• イダルビシン塩酸塩（Selleck Chemicals cat.）
• パノビノスタット（セレック・ケミカルズ cat.）
• ロミデプシン（R&D Systems社のカタログ番号3515）
• トラメチニブ（セレック・ケミカルズ cat.）

• SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）

方法

細胞の準備

3Dスフェロイド： MCF7またはTU-BcX-4IC細胞を384ウェルUボトムマイクロプレートにウェル当たり2500細胞ずつプレーティングした。プレートを1000rpmで1分間遠心し、細胞を凝集させた。その後、37℃、5% CO2で72時間インキュベートした。

2次元単層培養： MCF7細胞を384ウェル平底マイクロプレートに1ウェルあたり5000細胞ずつプレーティングした。プレートを37℃、5% CO2で24時間インキュベートした。TU-BcX-4IC細胞は、1ウェルあたり2500細胞でプレーティングし、48時間インキュベートした。

(2) オキサロ酢酸＋L-グルタミン酸

L-アスパラギン酸＋a-ケトグルタル酸

複合治療

2Dおよび3Dで培養したTU-BcX-4ICおよびMCF7細胞を、50 nMから0.006 nMまでのロミデプシンの1:5希釈系列で4重ウェル処理した。細胞は化合物とともに37℃、5% CO2で72時間インキュベートされた。

両培養形式のTU-Bcx-4IC細胞をボルテゾミブ、イブルチニブ、塩酸イダルビシン、パノビノスタット、トラメチニブでも処理した。細胞は化合物とともに37℃、5% CO2で72時間インキュベートされた。

インキュベーション後、CellTiter-Glo 3D試薬をアッセイウェルに添加した。3Dスフェロイドの場合、プレートを5分間振とうした後、室温で30分間インキュベートし、細胞を溶解させてから測定した。2D 培養の場合は、プレートを 2 分間振とうし、室温で 10 分間インキュベートしてから読み取った。プレートはSpectraMax iD5リーダーで、表1に示す発光検出モードと設定を用いて読み取った。すべてのデータ解析とグラフ化は、SoftMax Proソフトウェアを用いて行った。

表 1. CellTiter-Glo 3Dアッセイ用のSpectraMax iD5リーダー設定。設定は、SoftMax Pro ソフトウェアのプレートセクションで指定する。Read Heightは、More Settingsの "Show Pre-Read Optimization Options "にチェックを入れ、リード開始後に表示される指示に従って最適化する。

結果

化合物で処理した細胞の各セットの結果は、SoftMax Proソフトウェアの4パラメータロジスティックを使ってグラフ化し、各曲線のCパラメータをIC50値とした。ロミデプシンで処理したMCF7細胞では、IC50濃度は単層培養細胞よりも3次元培養細胞の方がやや高かった（図2）。ロミデプシンで処理したTU-BcX-4ICは、3次元培養細胞で2次元培養細胞よりわずかに低いIC50を示した（図2E）。試験した他の化合物では、IC50値は3D培養細胞でより高くなることが多く、3D培養と2D培養の結果の差は2～3倍程度であることが多かった（図3、表2）。

ロミデプシンで処理したTU-BxC-4IC細胞とMCF7細胞の間には明確な違いがあった。2D培養では、両細胞型ともIC50値は1.13nM対1.88nMと同程度であった。しかし、3次元培養では、TU-BxC-4IC細胞のIC50値は0.443nMと、MCF7細胞の5.28nMの12倍も低かった。このことは、TU-BcX-4IC細胞の培養方法が、MCF7細胞よりもこれらの細胞の反応に大きな影響を与えたことを示唆している。

表 3. . 化合物処理細胞のIC50値。値は、スフェロイド（3D）または単層（2D）として培養したMCF7およびTU-BcX-4IC細胞について記載した。IC50濃度はnMである。

結論

ルシフェラーゼを用いて、異なる実験条件下における細胞内の相対的ATP濃度の発光リードアウトを生成するアッセイは、細胞の生存率を迅速に評価する便利な方法である。細胞は容易にスフェロイドを形成するU底プレートに置 くことができ、ウェルの洗浄やスフェロイドの移動の必要なく、 化合物処理からATPアッセイまで一貫して行うことができる。その結果得られる細胞生存率のデータは、それだけでも興味深いものであり、またハイコンテントイメージングなどの他の方法でさらに調査する必要のある化合物や処理に研究者の注意を喚起することもある。

表 3. . 化合物処理細胞のIC50値。値は、スフェロイド（3D）または単層（2D）として培養したMCF7およびTU-BcX-4IC細胞について記載した。示したIC50濃度はnMである。

結論

ルシフェラーゼを用いて、異なる実験条件下で細胞内の相対的ATP濃度の発光リードアウトを生成するアッセイは、細胞の生存率を迅速に評価する便利な方法を提供する。細胞は容易にスフェロイドを形成するU底プレートに置くことができ、ウェルの洗浄やスフェロイドの移動の必要なく、化合物処理からATPアッセイまで一貫して行うことができる。その結果得られる細胞生存率のデータは、それだけでも興味深いものであり、またハイコンテントイメージングなどの他の方法でさらに調査する必要のある化合物や処理に研究者の注意を喚起することもある。

このアプリケーションノートでは、CellTiter-Glo 3Dアッセイを用いて、スフェロイドまたは単層として増殖させた2つの異なるタイプの細胞の生存率に対する、異なる化合物による処理の結果を比較することが可能であることを実証した。説明した細胞培養法とアッセイはセットアップが簡単で、中・高スループットのスクリーニングに適している。SpectraMax iD5リーダーは、堅牢なアッセイの読み出しに必要な感度を提供し、SoftMax Proソフトウェアによって自動化されたデータ解析とカーブフィッティングを行う。

参考文献

• Sirenko O、Brock CK、Lim A、Macha P、Nikolov E、Olsen C、McConnell EC、Wright M、Collins-Burow BM、Cromwell EF、Burow ME。ハイコンテントイメージングと解析による3Dトリプルネガティブ乳癌腫瘍の薬物応答評価。3 August 2022, PREPRINT (Version 1) available at Research Square https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1859525/v1.
• . Matossian MD, Chang T, Wright MK, Burks HE, Elliott S, Sabol RA, Wathieu H, Windsor GO, Alzoubi MS, King CT, Bursavich JB, Ham AM, Savoie JJ, Nguyen K, Baddoo M, Flemington E, Sirenko O, Cromwell EF, Hebert KL, ... Burow ME. Metaplastic breast carcinomaの新しい患者由来異種移植片モデルの詳細な特徴を明らかにし、まれな腫瘍型における実行可能な生物学的標的およびマトリックス進化のパターンを同定する。Clin Transl Oncol 24, 127-144 (2022). https://doi.org/10.1007/s12094-021-02677-8