Application Note GENEPIX-4000Bの信号対雑音比と
最適光電子増倍管のゲイン設定

はじめに

アレイスキャナーの性能を比較するための重要な基準は、生成される画像の質である。画質を評価する客観的な尺度の一つにSNR（信号対雑音比）がある。SNRが高くなると、背景画像やノイズから信号を識別する能力が向上します。SNRは、スキャンされた画像の品質を定量化するだけでなく、スキャナの検出限界や最適な光電子増倍管のゲイン設定を定義するためにも使用されます。

信号

アレイスキャナからのシグナルは、蛍光色素を光励起することで得られます。蛍光体から放出された光子は、光電子増倍管（PMT）*のような光検出デバイスの表面に集められます。光検出装置によって生成される信号（Sで表される）は、検出器に接触する発光光子の数（Nで表される）と検出システムの量子効率（QEで表される）の関数である。したがって、S＝N×QEとなる。信号の質は、生物学的要因と技術的要因（主にアレイスキャナーで使用される設計上の考慮事項に基づく）の両方に依存することを覚えておくことが重要である。例えば、放出された光子（N）の収集量を最大化するには、最大量の励起光をサンプルに照射するだけでなく、励起された蛍光体から放出された光を光子検出器に導くための効率的な経路を設計する必要があります。

ノイズ

すべてのシステムにおいて、暗電流ノイズとショットノイズの2つのノイズを考慮する必要があります。さらに、最適に設計されていないシステムでは、アナログ-デジタル変換プロセスや信号の増幅を含む多くの異なる領域でノイズが発生する可能性があります。

* ほとんどのレーザーベースアレイスキャナーは検出にPMTを使用しています。PMTは、検出器の一端に当たった光子を電子に変換し、電子がもう一方の端を通過する際に増幅します。増幅の量（ゲイン）は、PMTに印加する電圧を変えることで調整できる。

暗電流ノイズ： 光入力がない場合でも、光子検出デバイスからの熱放射は、暗電流ノイズと呼ばれる低量のノイズ（1秒あたりの電子数で測定）を発生させることがある。光電子増倍管の場合、暗電流ノイズは光電面や光電子増倍管のダイノードから漏れる電流に起因することがあります。GenePix 4000Bは、2つのアプローチにより暗電流ノイズを無視できるレベルまで低減するように設計されています： 1) GenePix 4000Bで使用するために選択されたPMTは、暗電流レベルが非常に低いこと、2) 各ピクセル上のレーザーの滞留時間が非常に短いため、各ピクセルで発生する暗電流電子の数が無視できるほど少ないこと。

ショットノイズ： ショットノイズまたは統計ノイズは、GenePix 4000Bで考慮する必要がある唯一の重要なタイプのノイズです。これは光の入力によって発生し、光子の可変性に起因します。ショットノイズでは、信号強度が増加するにつれて、ショットノイズは収集された信号の平方根として増加するため、信号強度が増加するにつれてSNRが実際に減少することを理解することが重要です。

信号対雑音比

信号対雑音比は、バックグラウンドノイズから真の信号を分離する能力の定量的尺度として、多くの信号検出分野（無線、エレクトロニクス、イメージングなど）で使用されている。蛍光アレイイメージングでは、SNRは一般的に以下のように計算される：

シグナル - バックグラウンド
バックグラウンドの標準偏差

SNRが高いほど、バックグラウンドノイズに対するシグナルが高いことを示す。一般的に、S/N比3が正確な検出の下限と考えられている。この値以下でもシグナルは検出されるが、定量測定の精度は著しく低下する。上式を参照すると、SNRはシグナルを増加させるか、バックグラウンドを減少させるか、ノイズ（すなわちバックグラウンドピクセルの標準偏差）を減少させることによって最大化することができる。

蛍光アレイでは、バックグラウンドシグナルの主な原因はサンプルと同じ焦点面における非特異的ハイブリダイゼーションである。SNR式の分子を増加させる最も効果的な方法は、ハイブリダイゼーションとストリンジェンシー洗浄条件を最適化し、非特異的ハイブリダイゼーションを最小限に抑えることです。

方程式の分母はバックグラウンドシグナルの "均一性 "によって決定されます。その要因には、プローブの純度やハイブリダイゼーションの均一性などの生化学的要因や、すべてのPMTに固有の迷光子や電子ノイズなどの装置要因が含まれます。アクソンインスツルメンツの中核となる専門技術は超低ノイズ信号増幅であり、GenePix 4000アレイスキャナーは装置ノイズのあらゆる原因を最小限に抑えるように設計されています。

SNRの重要性を反映して、GenePix Proには、スキャンされたマイクロアレイのSNRを自動的に計算し、各波長のSNRのヒストグラムを描くスクリプトが組み込まれています。また、以下に概説するように、SN比を手動で計算することもできる。どちらの方法でも、同じメーカーのスキャナーや異なるメーカーのスキャナーを比較するのに便利です。

1. 典型的なデータスライドを選ぶ。
2. 飽和ピクセルのない最も明るい画像が得られるPMT設定でスライドをスキャンする。
3. Excelで、S-B値（例えば、"F532 Median-B532 "列）をN値（例えば、"B532 SD "列）で割る。

GenePix 4000 アレイスキャナーで使用されている PMT のタイプはダイナミックレンジが広いため、アレイ化されたスポットの強い特異的シグナルと、主に非特異的ハイブリダイゼーションに起因する低レベルのバックグラウンド蛍光の両方を検出し、増幅します。単にゲインを最大まで上げても最適なSNRが得られない場合があります。従って、最適なPMT設定を経験的に決定する必要がある。最初のステップは、使用するプローブの希釈系列を作ることである。次に、SNRとPMTゲインの関係を決定する。これらのデータから、蛍光プローブに最適なPMT設定が得られる。以下に示すデータは、一般的に使用されるCy3およびCy5プローブについて、広範囲のPMT電圧と濃度との関係を示している。

1. 単一色素濃度におけるPMTゲインの関数としてのSNR。

以下の実験は、S/N比が約500Vまで改善し続けることを示している。500V以上のPMT利得は、濃度範囲の中央の色素濃度（図1A）でも検出限界付近（図1B）でも等しいSNRを与える。

2. 蛍光濃度の全範囲におけるPMTゲインの影響。

6桁に及ぶ色素Cy3（図2A）とCy5（図2B）の希釈系列を、PMT電圧の全範囲にわたってスキャンした。どの色素濃度においても、SNRは200Vから約500Vまで向上した。500Vを超えると、この希釈系列で最も高いスポットが飽和し始めるため、リニアレンジは上端で減少する。500Vから900Vの間のPMTゲインでは、どちらの色素でも検出限界に差はない。

結論

幅広いCy3およびCy5濃度において、GenePix 4000アレイスキャナーの最適なPMTゲインは、最も明るいシグナルが飽和以下である限り、500 Vから900 Vの範囲内である。

参考文献

Basarsky, T., Verdnik, D. Zhai, J.Y. and Wellis, D. Overview of a Microarray Scanner： マイクロアレイスキャナーの概要：統合された収集・解析プラットフォームのための設計要点。In： マイクロアレイ・バイオチップ技術。M. Schena (Ed.), BioTechniques Books, Natick, MA. (2000)