Application Note SpectraMax i3xマルチモードマイクロプレートリーダーの
ダイナミックレンジを拡大するSpectral Fusion™照明テクノロジー

多くのマイクロプレートリーダーや分光光度計は、蛍光や発光シグナルの検出に光電子増倍管（PMT）を使用しています。PMTは、最初に特定の波長で放出されるサンプルからの光子を検出し、それを電子に変換することで動作します。その後、電子増倍管によって信号が増幅され、相対蛍光単位または相対発光単位（RFUまたはRLU）で検出・表現されます。

このテクニカルノートでは、SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Readerに搭載されている特許取得済みのユニークなSpectral Fusion™イルミネーションとAutoPMT™機能に焦点を当てています。最適な感度を提供するだけでなく、シグナルレンジを最大化するために、光学部品と電子部品を組み合わせてデータを正規化するシステムについて説明しています。

PMTの仕組み

PMTは、フォトカソードに入射する光子をカウントし、電子に変換します。まず、電子は一次ダイノードに当たるように偏向され、その後、一連の後続ダイノードにわたって増幅される（図1）。したがって、生成される電子の数は入射光子の数に比例するが、PMTに印加される電圧または利得にも依存する。PMTの利得が低い場合、入射光子1個に対して生成される電子の数は、PMTの利得が高い場合に比べて少なくなる。

材料と方法

フルオレセイン溶液は、PBS中で初期濃度100μMで調製され、標準曲線を作成するために3倍ステップで希釈された。標準曲線は100μMから0.01nMまでの14種類の濃度で構成された。

Alexa Fluor 430色素溶液は、PBS中で初期濃度10μMで調製し、3倍ステップで希釈して標準曲線を作成した。標準曲線は10μMから0.1nMまでの10種類の濃度で作成した。

両方の蛍光体について、200μLの溶液を黒色96ウェルマイクロプ レートの3重ウェルに分注し、PBSをプレートブランクとした。プレートはSpectraMax i3xリーダーで、以下に概説する設定に従って測定した（表1）。シグナルを取得し、SoftMax Pro Data Acquisition and Analysisソフトウェアを用いて解析した。

表1. FluoresceinとAlexa Fluor 430の実験に使用した装置の設定。注：フルオレセイン（485 nm）とAlexa Fluor 430（425 nm）の励起にはフラッシュランプを、430 nmの励起にはLEDを使用。

Spectral Fusion™照明テクノロジー

ランプは、紫外域（250 nm～429 nm）と近赤外域（681 nm～850 nm）のサンプルを励起するために使用され、LEDは可視域（430 nm～680 nm）をカバーします。本装置は、ソフトウェアで指定された波長に応じて光源を自動的に選択する。キセノンフラッシュランプを使用する場合、励起光は一定に保たれ、PMTのゲインを調整して様々なサンプルの発光を測定することができます。この場合、SpectraMax i3x リーダーは、サポートアプリケーションノート「SpectraMax iD および M シリーズマルチモードリーダーにおける拡張ダイナミックレンジのための AutoPMT™ 機能」で説明されているように、フラッシュランプベースのマイクロプレートリーダーとして機能します。PMT ゲインは、手動、高、中、低、または自動に設定できる（図 3A）。AutoPMT 設定では、データ品質を損なうことなくダイナミックレンジを拡張できるため、利用可能な場合は選択する必要があります。

励起用に選択した波長が、LEDがカバーする範囲である430 nmから680 nmの間である場合（図2参照）、LED励起はマイクロプレートリーダーによって自動的に選択される。この場合、LED強度は調整されるが、PMTゲインは感度が最適となる範囲に固定される（図3B）。SpectraMax i3x リーダーは、測定に必要な最適 LED 強度を決定するため、各ウェルを自動的にプレリードする。この予備読み取り中、装置は利用可能な 4 種類の LED 強度レベルそれぞれでウェルを読み取り、最低レベルから開始する。最適なLEDレベルとは、PMTを最適なリニアカウントレンジで使用しながら、飽和することなく最大のシグナルが得られるレベルです。その結果、プレートの各ウェルは、それぞれ最適化されたLED強度レベルの励起を使用して読み取られます。

最後に、得られたRFU値は自動的に正規化され、広い濃度範囲にわたって直線性が得られる。フルオレセインでは、1回のマイクロプレート測定で最大6.5-logの濃度範囲を達成することができた（図5）。

LEDとキセノンフラッシュランプの比較

フラッシュランプと SpectraMax i3x マイクロプレートリーダーの LED で生成されたデータを比較するために、Alexa Fluor 430 染料を使用した。プレートを425 nmと430 nmで励起し、それぞれキセノンフラッシュランプまたはLEDを使用した。データを分析し、RFU値を手動で正規化することなく同じグラフにプロットした（図6）。2つの異なる光源で励起されているにもかかわらず、単一濃度では非常に類似したRFU値を示し、両曲線は密接に重なっていた。これは、キセノンフラッシュランプとLEDの間で信号の正規化が行われ、測定された信号が選択された光源に依存しないため、データを比較できるようになったためである。この正規化により、システムがキセノンフラッシュランプとLEDの間をシームレスに切り替えるため、信号のジャンプや低下がなく、装置の全レンジを通して波長スキャンを実行することができます。

さらに、LEDはキセノンフラッシュランプよりも強力な光源であるため、より多くの光がサンプルに到達し励起される。したがって、キセノンフラッシュランプの代わりにLEDを使用すること（そのような選択が可能な場合）で、低濃度におけるダイナミックレンジとデータの再現性を高めることができる。Alexa Fluor 430の標準曲線（図6）では、LED（励起波長430 nm）を使用することで、低濃度でのばらつきを抑え（％CVを小さく）、2倍希釈（1濃度対数）を余分に検出することができた。励起波長がLEDの波長範囲リミットのすぐ下またはすぐ上にあるアッセイでは、LEDに適合する励起波長を選択することで、明らかな利点が得られます。さらに、これらのアッセイに対して波長最適化ウィザードを実行することで、アプリケーションノート「SpectraMaxパラダイムプラットフォームとTUNEテクノロジーによる蛍光タンパク質の波長スキャニングの最適化」に記載されているように、リーダーが最適な励起／発光ペアを選択することが保証される。

LED光源の重要な利点は、シグナル強度が経時的、日次的、または異なるアッセイ条件によって変化するようなキネティックアッセイにあります。キセノンフラッシュランプを使用する装置では、キネティック測定時にPMTゲインを特定のゲイン（高、中、低）に固定する必要がある。ウェルに対してゲインが高すぎる場合、PMTが飽和するため、いくつかのキネティックポイントは測定されません。キネティクスプロファイルは重要な情報を見逃す可能性があり、結果の曲線は正しくプロットされない可能性があります。選択したゲインがシグナルに対して低すぎると、システムの感度が低くなり、結果として得られるキネティックプロファイルが最適な精度や正確さにならないことがあります。SpectraMax i3xリーダーでは、固定PMTゲインを備えた可変LED強度により、キネティックリードを含むすべてのリードタイプについて、1回のプレート測定で8～9対数のダイナミックレンジにわたるシグナル検出が可能です。これにより、システムは、飽和することなく、またデータ品質に妥協することなく、1枚のプレートで非常に低いシグナルと非常に高いシグナルの両方を検出することができます。

結論

アッセイ結果は、アッセイ設定条件、製造公差、ユーザーの経験不足など、さまざまな理由により、日によって、または装置によってわずかに異なることが一般的に認められています。SpectraMax® i3xリーダーに搭載されている特許取得済みのSpectral Fusion照明は、これらを補正するのに役立ち、研究者は常に高品質で再現性のある蛍光データを得ることができる。このユニークな設計により、システムは、データ品質を損なうことなく、広いダイナミックレンジにわたって完全な直線性を達成することができる。Spectral Fusionは、SpectraMax i3xリーダーで利用可能なすべての蛍光測定タイプ（エンドポイント、カイネティック、ウェルスキャン、スペクトル）で利用可能である。