Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーによる
温度制御カイネティクス

はじめに

キャスリーン・サロモ｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

温度制御カイネティック測定は、酵素反応や細胞ベースアッセイによく用いられます。ここでは、Molecular Devicesマイクロプレートリーダーのヒーティングエレメント設計に関する技術的背景と、温度制御カイネティックアッセイを使用する際の一般的なガイドラインについて説明します。

加熱エレメントの設計

Molecular Devicesマイクロプレートリーダーの製品ラインアップは様々な装置で構成されており、発熱体の設計や温度制御に関して異なるため、表1に示すように3つのカテゴリーに分類される。

表1：発熱体設計のカテゴリー。つの主なカテゴリーの中で、マイクロプレートリーダーは使用可能な最高温度が異なる場合がある。

SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーのようなカテゴリー1のマイクロプレートリーダーの発熱体設計は、温度制御にデュアルエリアセンサーを適用しています。一つのセンサーは上部チャンバー加熱ホイルの温度を測定し、もう一つのセンサーは下部チャンバー加熱ホイルの温度を測定するために使用される。各加熱エレメントは比例積分微分（PID）コントローラーにより独立して制御され、正確な温度制御を保証する。さらに、図1に示すように、勾配加熱設計（上部加熱ホイルの温度が下部加熱ホイルより高い）が適用されている。これにより、粘着シールやプラスチック製リッドで覆われたマイクロプレートの結露を低減します。

カテゴリー2と3のマイクロプレートリーダーも同様にグラジエント加熱を採用している。カテゴリー1とは対照的に、複数の加熱エレメントがプレートチャンバー内に配置されている。カテゴリー3のマイクロプレートリーダーのプレートチャンバーには、プレートキャリッジの上下の様々な位置に4つのヒーターがあります（さらにキュベット用に1つのヒーターもあります）。カテゴリー2と3のマイクロプレートリーダーは、プレートチャンバー内の熱分布の改善をサポートするため、2006年にファームウェアの変更が適用されました。最新のファームウェアをお使いいただくには、モレキュラーデバイスのテクニカルサポートチームにお問い合わせください。

勾配加熱を適用しないマイクロプレートリーダーで使用する蓋付きマイクロプレートは、蓋の裏側に結露が生じ、測定の妨げとなる迷光が発生することがあります。これは、光がサンプルに到達する前に蓋を通過しなければならない吸光度だけでなく、蛍光トップ測定においても極めて重要である。温度制御カイネティクスで観察されるその他の問題は、蒸発、蒸発による体積効果、温度勾配による不均一性である。次のセクションでは、温度に敏感なカイネティック測定に関する一般的な推奨事項を示す。

温度制御カイネティクスのための一般的推奨事項

リーダーのマイクロプレートチャンバー内の温度を安定させるため、実験を開始する前に温度制御をオンにすることを推奨する。マイクロプレートチャンバーは、室温から 37℃～45℃の設定温度まで少なくとも 15 分間必要である。

温度平衡化の間、およびアッセイマイクロプレートの温度を維持する間、いわゆる「エッジ効果」がデータに現れ、結果の解釈を困難にすることがあります。エッジ効果とは、マイクロプレートのウェル周囲で発生する蒸発がアッセイ結果に及ぼす影響のことです。データにエッジ効果が見られると思われる場合は、実験セットアップをテストする必要があります。セットアップの均一性をテストするには、マイクロプレートの中央部だけでなく、各コーナーにもコントロールウェルを使用します。マイクロプレート全体に対照サンプルをローディングすると、マイクロプレート全体に潜在するグラジエント効果をよりよく見ることができます。

一般的なガイドラインとして、96穴マイクロプレート中の100μLの試薬を21℃から37℃まで温めるのに約30分かかると考えてください。マイクロプレートが外縁から中央部に向かって温まるにつれて、96穴マイクロプレート全体が安定した温度になるまでにさらに15～30分かかることがあります。目的の温度への平衡化時間を短縮するには、マイクロプレートと試薬の予熱を考慮 してください。マイクロプレートを予熱するには、目的の温度のヒートブロックの上に置き、予熱した試薬を加え、充填したマイクロプレートを予熱したマイクロプレートリーダーに移します。

あるいは、ほとんどの試薬を封じ込めたマイクロプレートをマイクロプレートリー ダーで予備加温し、マイクロプレートの読み取りを開始する直前に予備加温した最終試薬を加え て反応を開始することもできる。最終試薬の予備加温ができない場合は、反応総量の最大 1/10 を使用し、マイクロプレートを読み取る前に振とうして適切な混合を確保する。

目標温度に達すると、外側のウェルは温度を維持するためにより多くのエネルギーを必要とするため、熱対流と蒸発が増加します。このため、細胞ベースアッセイでは、特に高密度384ウェルマイクロプ レートのようなウェル容積の小さいマイクロプレートでは、外側のウェルに細胞の偏在が見られること がよくあります。アッセイ用マイクロプレートの初期加温段階では、外側ウェルの蒸発速度の増加により、マイクロプレートの内側ウェルに対して相対的に温度が低下する。このエッジ効果を避ける一つの方法は、外側のウェルを水で満たし、実際のアッセイには内側のウェルだけを使用することです。

あるいは、ウェルとウェルの間や周囲を液体で満たすことができるマイクロプレートや、96ウェルすべてをアッセイに使用できるように液体で満たすことができる外側の堀があるマイクロプレートを使用する1,2。このようなマイクロプレートは、エッジ効果や蒸発を抑え、細胞ベースアッセイ用に開発された。温度に敏感な酵素アッセイにこのマイクロプレートを使用した経験から、ウェル間のスペースは満たさない方がよい。

マイクロプレートカバーを使用すると、蒸発を抑え、隣接するウェルの汚染を防ぐことができる。プラスチックの蓋、シーラント、あるいはミネラルオイル（該当する場合）をカバーとして使用することができる。結露リング付きの透明なプラスチック蓋は、ウェル間のコンタミネーションを減らすと同時に、実験中のガス交換を可能にする。このような蓋は簡単に取り外して取り替えることができるので、カイネティック実験中いつでも試薬を加えることができる。蒸発をできるだけ少なくする必要がある場合は、粘着性シーリングシートが蓋の代用となる。粘着剤がウェルの領域にあるシーリングシートは、透けて読めないので推奨されません。透明でないシーリングシートは、蛍光下方測定を行う場合にのみ使用する。

吸光度やトップリード蛍光など、他のすべてのタイプの読み取りには、ウェルエッジ部分に強力な粘着剤を使用した光学的に透明な窓のあるシーリングシート、またはqPCRに通常使用される光学的に透明なヒートシールの使用を推奨します。ガス透過性の光学的に透明なシーリングシートも市販されているが、一般的にガス透過率は低い。透視が必要な透明カバーの場合、表面の反射特性のため、光路内の光強度が低下することに留意してください。紫外（UV）波長領域で作業する必要がある場合は、ウェル底部および使用するカバー材のUV透過性を確認する3,4。下方測定を行う場合、測定成分に干渉しないのであれば、ミネラルオイルも選択肢の一つです。より高いガス交換速度が必要な場合は、非透過性のガス透過性シーリングメンブレンが底部リードに使用できます。

カバーを通して読み取る必要があり、マイクロプレートリーダーでインキュベートしている間に凝縮液が形成される場合は、カイネティック測定の前または間にシェイクステップを適用して、カバー上の液滴が落ちるようにします（凝縮液が形成される性質は材料によって異なります）。蛍光測定では、可能であれば下方からの測定を行い、底が黒く透明なマイクロプレートを使用する。こうすることで、カバーの結露による迷光の影響を避けることができる。

マイクロプレートをリーダーに加える前に結露が生じた場合、それはハンドリングの問題である可能性が高い。結露が蓋の下に蓄積し、カイネティック測定の開始時に結果を歪める可能性があるため、予熱したマイクロプレートを予熱したリーダーに入れる前に室温で過ごす時間を最小限にする。これは、マイクロプレートリーダーの外でのマイクロプレートのインキュベーション温度が、マイクロプレートリーダーの内部よりも高い場合、すなわちマイクロプレートが37℃のインキュベーターでインキュベートされ、その後30℃のマイクロプレートリーダーで測定される場合にも適用される。これは吸光度およびトップリード蛍光に適用される。

カイネティック吸光度アッセイでは、アッセイ容量に依存する経路長が Vmax 速度または勾配の決定に影響するため、すべてのウェルで必ず同じ容量を使用する（図 2 参照）。

ここに記載した情報はアッセイセットアップのガイダンスとなりますが、SpectraMaxマイクロプレートリーダーで各アッセイを最適化することで、最良の結果を得ることができます。以下は一般的なチェックリストです：

1. 使用前にマイクロプレートリーダーのマイクロプレートチャンバー を温めるのに十分な時間を確保してください。
2. 温度勾配、蒸発、コンタミネーションなどの影響をチェックするため に、サンプルコントロールウェルを使用する。
3. エッジ効果を減らすには
   ⚪︎試薬とマイクロプレートをあらかじめ温めておく。
   ⚪︎外側のウェルの使用を避けるか、外側の堀があるマイクロプレートに変更する。
4. 蒸発と汚染を最小限に抑えるには、マイクロプレートカバーを使用する。
5. 蓋付きマイクロプレートの結露を避けるには
   ⚪︎マイクロプレートの取り扱い中の温度変化を最小限にする。
   ⚪︎高温から低温へのマイクロプレートの移動を避ける。
6. 該当する場合は、蛍光アッセイは下方から測定を行う。
7. すべてのウェルで同じ容量を使用してください。

参考文献

1. エッペンドルフ96ウェル細胞培養マイクロプレート-細胞ベースアッセイにおけるエッジ効果を最小化する簡単な方法、アプリケーションノート326 2014年4月、エッペンドルフAG、ドイツ
2. Thermo Scientific Nunc Edge Plate Technical Information - Intrawell Cell Distribution in MicroWell Edge Plates, アプリケーションノート, Thermo Fisher Scientific Inc, USA
3. マイクロプレート中のDNAのUV吸光度測定、Evelyn
4. L. McGown, BioTechniques 28:60-64 (January 2000)
5. マイクロプレートにおけるUV/VIS分光法、アプリケーションノート073 041 2008年4月、Greiner Bio-One GmbH、ドイツ