Application Note クローンピクス・システムによるモノクローナリティの評価

哺乳類細胞株のスクリーニングと選択を簡素化するシステムを確立

オミー・アーメド、ジュリアン・バーク、クリストファー・マン、スカイ・ジャン、ケレンサ・クロットラップ、ナタリー・スミザーズ、モレキュラー・デバイセズ、LLC、1311オーリンズドライブ、サニーベール、カリフォルニア州94089。チュートリアル：2009年11月1日（第29巻第19号）

限界希釈法、リングクローニング法、あるいは単純な手作業によるコロニーの収集によって哺乳動物細胞のクローン候補を単離することは、時間がかかり、資源を必要とし、コストがかかる手順であり、細胞のクロスコンタミネーションやユーザーエラーが起こりやすい。一般的に遭遇する大きな欠点の一つは、治療用タンパク質や抗体の生産に不可欠なステップであるモノクローナリティーの確立が困難なことである。

選択的な哺乳類細胞クローンの単離に通常伴う欠点の多くを克服するために、Genetix社は分泌細胞株のスクリーニングと選択のためのClonePix™システムを開発した。ClonePixシステムの有用性は、数千のクローンから分泌されるタンパク質をin situで可視化・定量化し、最高価値の分泌物だけを正確に選択・単離する能力にあり、時間スケールを短縮し、下流の培養を簡素化する。

ClonePixシステムソリューションは、分泌抗体や単量体タンパク質、細胞表面タンパク質、内在性GFP融合タンパク質を特異的に検出することが検証されています。ハイブリドーマ、骨髄腫、HEK293、懸濁適応細胞および接着CHO細胞を含む様々な細胞種に適合します。

ワークフロー

ワークフロー（図1）における基本的な初期段階は、哺乳類細胞株を半固形培地で培養することであり、その際、細胞はそれぞれ単一の親細胞に由来する個別のコロニーを形成する。数千個の細胞からなる異種集団は、1ウェルまたは6ウェルマイクロプレートでクローンコロニーに増殖される。その後、白色光を用いてコロニーを検出し、蛍光を用いてin situで分泌タンパク質を定量することにより、細胞を迅速にスクリーニングする。

分泌タンパク質検出アッセイでは、蛍光検出プローブを用いて分泌産物をコロニーの周囲に固定化する必要がある。専用のClonePixシステム・ソフトウェアが各コロニーに関連する蛍光を定量し、最も望ましいクローンのみを96ウェルの目的プレートへ自動ピッキングする。図2は、最も生産性の高いクローンを特定する画像例である。異なる蛍光色素で標識された検出剤を使用することにより、様々な異なるタンパク質を同時に検出・単離することができる（マルチプレキシング）。

ハイブリドーマ融合の場合、抗原を検出プローブとして追加することで、抗原特異性に基づいてクローンを選択することができます；これは蛍光と直接結合させることも、二次検出剤を介して結合させることもできます。摘出されたコロニーのプレートは、単クローン性を評価するためにClonePix Systemを使用してコンフルエンスまで培養されます。 ClonePix™ Systemは、クローンの拡大およびスケールアップのための準備です。

単クローン性の評価：統計

半固形培地から採取したハイブリドーマのクローナリティは以前に評価され、適切な播種密度では、一致（非クローナリティ）の確率は4％であると結論付けられています。Genetix社はまた、モノクローナリティーの確率と播種密度／コロニーの大きさとの相関関係を示す統計計算も作成しました。

典型的な実験では、CHO細胞を半固形培地にプレーティングし、直径35 mmのウェル（すなわち、6ウェルのマイクロプレートウェル）あたり25個のコロニーを形成させる。14日目のコロニーの直径は約0.75mmである。式（0.25 x Pi x (0.75+0.75)2 x (n-1)）/（0.25 x Pi x 352）を用いると、コロニー数n=25の場合、偶然の一致の確率は4.4%であるため、1ラウンドのクローニングにおける単クローン性の確率は95.6%となるはずである。これは前回求めた値に非常に近い。

モノクローナリティの評価：実験

この統計理論を実験的に検証するため、2つのIgG分泌ハイブリドーマ細胞株（一方はIgG1を分泌し、もう一方はIgG2aを分泌する）を組み合わせた。IgG1およびIgG2aに対する蛍光標識アイソタイプ特異的抗体存在下、コロニーをCloneMatrixベースの半固形培地で増殖させた。AlexaFluor488標識抗IgG1はClonePixシステムのFITCチャンネルで可視化し、AlexaFluor546標識抗IgG2aはローダミンチャンネルで可視化した。代表的な画像を図3に示す。

コロニーはClonePix Systemソフトウェアを用いて解析され、ローダミン強度が低くFITCの外形平均強度が高い（IgG1分泌体の場合）か、ローダミン強度が高くFITCが低い（IgG2a分泌体の場合）かによって区別してピックされた。

合計312コロニー（各タイプ156個）を摘出し、96ウェルプレートで4日間培養した。その後、コンディショニング培地を、アイソタイプ特異的ELISAアッセイ（Bethyl Laboratories）を用いてIgG1およびIgG2aについて評価した。

IgG1およびIgG2aの両方について、発育不良またはELISAが陰性の細胞は除外された。その結果、IgG1特異的蛍光に基づいて選んだ143のコロニーのうち、低レベルのIgG2aを示したのは1つだけであった（clonality=99.3%）。IgG2a特異的蛍光に基づいて採取された81個のIgG2aコロニーのうち、3個は不均一であった（clonality=96.4%）。完全なデータセットのMonoclonalityは98.25％と計算された。

この実験データは、ClonePixシステムで1回のピッキングを行った後のクローナリティが、より大きなサイズのコロニー（直径0.75mm）をピッキングした場合、95.6%以上であるという統計的評価を検証するものである。同じ計算式を用いると、より早い時点（コロニーの直径が0.35mmしかない時点）でピッキングすることで、モノクローナリティの確率は99.0%に増加することが計算できる。さらに、2回目のクローニング（ピッキングしたクローンを複製し、再度ピッキングすること）を行うと、モノクローナリティの確率は99.9％に増加する。

概要

ClonePixシステムは、治療用タンパク質や研究用モノクローナル抗体の生産に通常使用される分泌性哺乳類細胞株の迅速なスクリーニングと単離のための強力なツールとして実証されている。このシステムは全体的な生産性を向上させ、抗体の特性評価や新規プロジェクトの開始により多くの時間を割くことができる。このチュートリアルで示されたデータは、半固形培地から哺乳類細胞のコロニーを摘出することが、クローン性細胞株を単離する効果的な手段であるという考えを裏付けています。

オミー・アーメッドは学生ラボ技術者、ジュリアン・F・バーク博士はGenetix社のCSO、クリストファー・J・マン博士（chris.mann@ genetix.com）はシニア・アプリケーション・サポート・スペシャリスト、スカイ・ジャンはリサーチ・マネージャー、ケレンサ・J・クロットラップ博士はシニア・サイエンティスト、ナタリー・スミザーズ博士はポスドク・サイエンティスト。ウェブ：www.moleculardevices.com/genetix.