ImageXpress Picoシステムを用いて
小児呼吸器感染症の免疫反応について新たな知見を得る
企業／大学
シアトル小児病院シアトル小児研究所、ワシントン大学ベナロヤ研究所
チームメンバー
筆頭著者 Stephen R. Reeves博士。
シアトル小児研究所主任研究員。
シアトル小児科呼吸器・睡眠医学部門主治医。
シアトル小児病院呼吸器・睡眠医学部門主治医。
使用製品
ImageXpress Pico自動細胞イメージングシステム
課題
RSVに感染したヒト肺線維芽細胞の細胞外マトリックスにおけるマストセルとHAの結合特性を理解すること
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は世界中の小児が感染する最も一般的なウイルスの一つである。軽症例では上気道（鼻と喉）の炎症にとどまるが、重症例では下気道（気管支と肺）まで達し、咳、微熱、食欲不振を伴う。
LUVAセルとヒト肺線維芽細胞（HLF）のECMとの相互作用を解析するReeves博士と共同研究者たち。
より重篤なRSV感染症は肺炎、呼吸不全、死に至ることもある。RSVは感染力が強く、主に小児が罹患する。しかし、成人や免疫力の低下した人も感染しやすい。RSVの症状や感染経路は、インフルエンザAおよびB、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルスCOVID-19など、上気道や下気道を冒す他のウイルスと類似している。
これらのウイルスの根本的なメカニズムを解明することで、治療法の可能性が見えてくるかもしれない。シアトル小児研究所、ワシントン大学、ベナロヤ研究所の研究者たちは、RSVに関するこれらの潜在的メカニズムの1つを研究することにした。
Stephen Reeves博士と彼の共同研究者は、RSVに感染したヒト肺線維芽細胞（HLF）におけるマスト細胞とヒアルロン酸（HA）の相互作用による下流の炎症効果を決定するためにいくつかの実験を計画した。細胞外マトリックス(ECM)内のHAの位置と作用機序、肥満細胞タンパク質の発現、HA、肥満細胞、ECM間の分子間相互作用を含む様々な条件をテストするために、生細胞イメージングと固定細胞蛍光イメージングの両方が必要であった。従来の蛍光顕微鏡法では、固定細胞のイメージングにガラスカバースリップを使う必要があり、その結果組織の取り扱いと処理時間が増えた。Reeves博士と彼のチームは、より効率的な方法で生細胞と固定組織の両方の高画質イメージングができる先進システムを必要としていた。
解決策
高解像度の生細胞および固定細胞の蛍光イメージングと解析
研究チームは、使いやすさ、柔軟性、ロバスト性の高い分析物を求めてImageXpress® Pico自動細胞イメージングシステムを選択しました。
アッセイプロトコル
研究チームが迅速に実験を開始できるよう、当社のフィールドアプリケーションサイエンティストとテクニカルサポートスペシャリストが、さまざまなアッセイのオンサイトトレーニングとサポートを提供しました。これには、アッセイプロトコルの開発やOn-the-fly解析も含まれ、画像の収集と解析を同時に行うことができました。
画像取得
研究チームは生細胞イメージングを行い、その後組織を固定して、生細胞技術では容易に可視化できない細胞外マトリックス成分を染色した。ImageXpress Picoシステムにより、研究チームはマルチウェルプレートを用いてすべてのイメージングを行うことができ、サンプルのハンドリングと処理にかかる時間を大幅に短縮することができた。画像取得の一環として、高倍率対物レンズで広い対象オブジェクトのスティッチングが行われた。これにより、従来のエピフローレンス顕微鏡で検査する複製を追加する必要がなくなり、より高品質の画像が得られた。
分析
Reeves博士と彼の共同研究者らは、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）に感染したヒト肺線維芽細胞（HLF）のマスト細胞（すなわちLUVA細胞）とECMとの相互作用の定量的解析を行うことができた。以下の画像と解析データを参照。
また、ImageXpress Picoシステムを用いて、RSV感染HLFのTSG-6発現と肥満細胞（すなわちLUVA細胞）接着に対する影響を48時間にわたって解析した。
以下の画像と解析データを参照
. (注：TSG-6は炎症に関連するタンパク質で、RSV感染細胞で発現が上昇することが示されている）。
使用製品
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ImageXpress Pico 自動細胞イメージングシステム
ImageXpress Picoシステムは、堅牢性と信頼性に優れた自動細胞イメージングシステムです。この手頃な価格の細胞イメージング装置は、個々の生物製剤ラボや、ハイスループットスクリーニングアプリケーション用にスケールアップを検討しているラボ向けに設計されています。コンパクトな設置面積で、高解像度の画像と強力な解析機能を兼ね備えており、あらゆるレベルのユーザーエクスペリエンスに対応します。デジタルコンフォーカルなどの高度な機能とともに、細胞ベースアッセイ用にあらかじめ設定されたプロトコルの包括的なポートフォリオを備えています。固定細胞や生細胞の蛍光アッセイや明視野アッセイを行う場合でも、ImageXpress Picoシステムは数回のクリックでイメージングを開始し、データを生成できるように設計されています！
結果
高品質データにより、科学的ブレークスルーを早期に実現
ImageXpress Picoシステムを用いて、Reeves博士のチームは初めて次のことを証明した：
- RSVに感染した小児ドナー由来のHLFでは、HA合成がより多く、その結果HAが濃縮された細胞外マトリックス（ECM）が形成される。
- HAで濃縮されたECMは、肥満細胞の強い接着を促進し、炎症反応（例えば気道収縮、粘液産生、咳）に寄与する肥満細胞プロテアーゼの放出を増加させる。
- RSVに感染したHLFでは、肥満細胞による炎症性メディエーターの発現が増加し、肥満細胞の接着も増加している。
この研究から得られた知見は、HAを濃縮したECMの形成が、急性呼吸器ウイルス感染時に炎症性環境を促進することを示している。このメカニズムは、RSVや他の呼吸器系ウイルスの治療的介入に大きな意味を持つ可能性がある。
発見の要約 本研究は、RSVによるHLFの感染が、HAを合成する酵素（HAS 2&3） のアップレギュレーションを誘導する一方、HAを分解する酵素（HYAL 2）のダウンレギュレーションを誘導し、その結果ECMへのHAの蓄積が増加し、マスト細胞の接着が促進されることを示した。さらに、RSV感染HLFはTSG-6の発現増加を示し、これがマストセルのECMへの結合を高める。RSVに誘導されたECMに結合したマスト細胞は、炎症性環境に寄与するマスト細胞プロテアーゼの発現をアップレギュレートする。
参考文献
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6997473/
「ImageXpress Picoシステムは、常に変化し続ける我々のニーズを満たすために進化し続け、さらなる発見の扉を開いています。次に何が来るか楽しみです。」
- Stephen R. Reeves博士、シアトル小児研究所主任研究員、シアトル小児病院呼吸器・睡眠医学部門主治医
Reeves博士と他の著者はJason Debley博士の研究室に所属している。Debbley研究室では、疫学的、臨床的、分子生物学的手法を駆使して、幼児期の喘息の進化を理解し、小児喘息における気道上皮の役割を研究している。
シアトル小児研究所の免疫・免疫療法センターの研究者たちは、ヒトの免疫系に影響を及ぼす最も困難な小児疾患のいくつかを研究している。最終的な目標は、免疫学の治療力を利用して新しい疾患治療法を考案することである。
